透射电子显微镜样品的制备方法及技术综述

卢照, 魏慧欣, 陈霞, 曾红霞, 丁雨葵, 宋武林,2*

(1.华中科技大学分析测试中心, 武汉 430074; 2.华中科技大学材料科学与工程学院, 武汉 430074)

1932年,德国科学家Knoll和Ruska成功研制出世界上第一台透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)。经过近90年的发展,TEM分辨率已经从亚微米量级提升至原子尺度级别的亚纳米量级[1],功能也趋于多样化,现如今广泛应用于材料科学、生命科学、物理学等领域,是当今科学研究不可或缺的表征工具之一。

透射电子显微镜是采用波长很短的电子束透过样品成像,由于电子束的穿透能力较弱,因此,对于TEM样品的厚度有一定的要求,而且通过TEM观察的区域一定要代表所研究的材料。理想的TEM样品要求均匀分散或均匀减薄,具有良好的导电性,同时耐电子束轰击。TEM样品制备的方法有很多种[2-6],材料的类型不同,选取的制样方法就会有所不同。适合的制样方法对透射电镜的观察效果有着重要的影响。比如,粉末样品或者材料分散液采用超声分散法[7];合金样品可以选择单独采用或者结合双喷电解抛光法、离子减薄法或者聚焦离子束技术这几种方法[8-12];对于一些有机样品或者生物样品,可以选择超薄切片技术[13-14]或者负染法[15]。现结合近几年来的相关报道,重点介绍几种目前适用于TEM样品的制备方法及技术。

1 超声分散法

对于粉末状纳米材料或纳米材料分散液,最常用的制样方法就是超声波法[16-20]。超声波法主要操作步骤如下:取少量样品放入易挥发、与样品不发生反应的溶剂当中,用超声波充分分散后滴至微栅或支持膜上,常温自然干或红外灯烘干便可进行TEM观察。根据样品的性质选择合适的溶剂,常用的溶剂有水、乙醇、丙酮、氯仿等。对于样品尺寸偏大导致电子束无法穿透的材料,可以先将试样放入玛瑙研钵中研碎再进行超声分散,比如氧化物陶瓷材料。图1[21]为聚苯乙烯(PS)、表面为十二烷基磺酸钠的聚苯乙烯(PS/SDS)、聚苯乙烯/聚多巴胺(PS/PDA)

图1 四种不同纳米粒子的TEM照片[21]Fig.1 TEM images of four different kinds of nanoparticles[21]

以及表面为十二烷基磺酸钠的聚苯乙烯/聚多巴胺(PS/SDS/PDA)纳米粒子的TEM结果,其制样方法为去离子水超声分散,再用滴管吸取少量滴置铜网上。图2[22]是将催化剂研磨后取少许样品分散在乙醇中,超声分散2 min后将表面附有碳膜的铜网浸入乙醇分散液中取样,最后晾干得到的TEM结果。

图2 γ-Al2O3固载咪唑对甲苯磺酸盐离子液体催化剂TEM照片[22]Fig.2 TEM images of [Hmim]TsO/γ-Al2O3 liquid catalyst[22]

2 双喷电解抛光法

双喷电解抛光法主要用于制备金属和合金薄膜试样[23-26]。在双喷电解抛光之前,样品一般要进行预减薄,其操作流程如下:用精密切割机或复式线锯将块体试样切成0.3 mm左右的均匀薄片。接着用砂纸将薄片机械研磨至100 μm左右的厚度。随后机械抛光或使用化学抛光液将薄片减薄至40 μm左右,最后用冲孔机冲下Ф3 mm的圆片以备终减薄使用。双喷电解法是终减薄的其中一种方法,其原理如图3所示:将抛光好的薄片作为阳极,用白金或不锈钢作为阴极,在阳极试样中心的两侧喷射电解液进行双喷电解减薄。当圆片的中心出现小孔,电解双喷设备的光敏元件输出电讯号,抛光线路电源切断,电解减薄终止。随后立即将薄膜放入酒精中漂洗干净以防形成氧化物类的污染层。张继明等[27]利用FEI-F30高分辨透射电镜对X100高级管线钢中的马奥岛(MA)组织进行了详细研究分析,部分TEM结果如图4所示。其样品的处理方法采用的是双喷电解减薄法。详细步骤如下:利用线切割方法在小尺寸试样的横截面上切下0.5 mm厚度薄片,在砂纸上机械减薄至约50 μm厚度薄片,然后利用Gatan冲样机冲下Ф3 mm的圆片。随后在司特尔Tenupol-5双喷减薄仪上进行电解双喷减薄,电解液为5%的高氯酸酒精溶液,减薄电压为20 V,液氮制冷,使电解液的温度始终保持在-20～-30 ℃。当电解双喷的试样穿孔后,立即将试样取出并用酒精冲洗干净,充分干燥后放入样品盒中备用。Wang等[28]利用透射电子显微镜对5052铝合金的组织结构进行分析时,对试样的处理方法采用的也是双喷电解法,其电解双喷的条件如下:机械预减薄至50 μm的厚度,随后进行电解双喷,电解液的组成为30% HNO3+70% CH3OH(体积分数),直流电压为16～20 V,温度保持在-20 ℃。其TEM结果如图5所示。电解电压、电流、电解液的成分、温度是双喷电解制备TEM薄膜样品的关键。不同的TEM样品制备条件都不一样,如表1所示。

图3 双喷电解减薄法的示意图Fig.3 Schematic illustration of twin-jet electropolishing method

表1 电解双喷减薄液的成分及减薄条件

TM为孪晶马氏体;RA为残留奥氏体图4 X100管线钢中马奥岛(MA)精细结构的TEM分析[27]Fig.4 TEM analysis of fine structure of MA island in the X100 pipeline steel[27]

B为晶向指数;N为应力图5 不同条件下的TEM图[28]Fig.5 TEM images at different conditions[28]

3 离子减薄法

离子减薄法可用于陶瓷材料、合金、复合材料、多相半导体以及截面样品的TEM样品制备[45-50]。使用离子减薄方法制备TEM样品之前,同样需要对样品进行预减薄,一般采用机械研磨的方法或金刚石切割器将试样减薄为100 μm厚度的薄片,随后用冲孔机冲下Ф3 mm的圆片,对于陶瓷等脆性材料,需要用Ф3 mm的金属环补强。再用凹坑机在圆片中央部位磨出一个凹坑以备离子减薄使用。离子减薄主要是利用高能惰性气体离子(通常使用的是Ar离子)轰击试样表面,使表面的原子溅射出来,其原理图如图6所示,试样在一特殊架上旋转,离子束在样品的两侧以一定的倾角(5°～30°)轰击样品相反的两个面。开始时一般选择快速减薄,设定高入射角的离子束。随着样品减薄特别是接近穿孔或已穿孔,离子束入射角要减小,以减少试样表面损伤。所有材料在减薄过程中,最好使用液氮制冷以避免离子损伤产生的空穴引起扩散性的改变。样品预减薄的厚度、离子束的入射角、电压、束流大小等都会影响试样的减薄效果,不同的样品,工艺参数就会有所区别。江鹏等[51]研究的Al-5Ti-1B合金采用的制样方法就是离子减薄法,先通过机械减薄的方法将试样减薄至80 μm的厚度,然后用Gatan的691离子减薄仪进一步减薄,初始条件为离子束射角8°,电压4.4 kV,电流0.02 mA。当试样中心出现微孔时,将入射角降低至6°,继续减薄20 min。样品制备完毕后,用场发射透射电镜Tecnai F30对其薄区进行观察,结果如图7所示。Hamu等[48]研究的AZ31镁合金也是采用离子减薄法制备的TEM样品,其制备过程如下:先从样品中心切下直径6 mm,厚度0.2 mm的薄片,然后机械抛光并冲下Ф3 mm的圆片,再在圆片中央部位磨出一个约为10 μm的凹坑,最后使用Gatan的691离子减薄仪进行减薄,电压设定在5.0 kV,入射角为6°～4°。制备好的薄膜样品使用透射电子显微镜JEOL 2010进行观察,其结果如图8所示。

图6 离子减薄法的示意图Fig.6 Schematic illustration of ion milling method

图7 TiB的TEM明场相及其SAED花样[51]Fig.7 TEM bright field image of TiB and its SAED pattern[51]

图8 AZ31合金的TEM图片[48]Fig.8 TEM image of the cast AZ31 alloy[48]

4 聚焦离子束技术(FIB)

聚焦离子束技术适用范围相当广泛,大多数块体材料的TEM样品都可以采用聚焦离子束(focused ion beam, FIB)技术,与传统的电解双喷和离子减薄等制样方法相比,该技术具有精度高、速度快、成功率高等特点,特别是可以制备出具有特定微观区域的TEM样品[52-58]。该技术由聚焦离子束扫描电子显微镜(FIB-SEM双束系统)来完成,其工作原理如图9所示。电子束垂直安装,离子束与电子束成一定的夹角安装,通常称电子束和离子束焦平面的交点为共心高度位置,在使用过程中样品处于共心高度的位置即可同时实现离子束加工和电子束成像,并可以通过样品台的倾转使样品表面与电子束或离子束垂直。目前最常用的离子源为液态金属Ga离子源,它具有低熔点,低蒸气压,良好抗氧化性,且束流范围大,束斑尺寸小等特性。

图9 FIB-SEM 双束系统示意图Fig.9 Schematic illustration of FIB-SEM dual-beam system

付琴琴等[59]对FIB-SEM双束技术做了简要介绍和典型的应用展示,其中包括透射电镜样品的制备。透射电镜样品的制备可以分为非提取法和提取法两种。非提取法是针对已经预减薄的样品,只需在其上面对感兴趣区域进一步定点FIB加工即可制得TEM样品,如图10所示。提取法是采用能够提高样品自支撑性的H形或X形方法对样品进行整体减薄,图11即为H形减薄方法制备的TEM样品。Sun等[57]利用透射电子显微镜观察7150铝合金微观结构以探究其腐蚀性能,其TEM薄膜样品就是使用FEI公司Helios系列FIB-SEM双束系统制得。制备过程和制备条件如下:首先在感兴趣的区域表面镀上一层Pt(保护层),然后提取样品,最后通过离子束进行减薄。为了减小离子束造成的损伤,减薄条件设定为电压2 kV,电流23 pA。图12(a)为7150铝合金薄膜提取的位置图,图12(b)和图12(c)为感兴趣区域的STEM-HAADF图。

图10 非提取法制备 TEM 样品[59]Fig.10 A typical TEM sample prepared through non-lift-out method[59]

图11 H形减薄样品[59]Fig.11 A sample thinned through H-type technology[59]

图12 7150铝合金的微观结构[57]Fig.12 Microstructures of 7150 Al alloy [57]

5 超薄切片技术

超薄切片技术多适用于制备生物样品、聚合物样品以及比较软的无机材料的TEM样品[60-65]。生物样品的制备过程相对复杂,大致可以分为以下几个步骤:取材、固定、漂洗、脱水、浸透、包埋、修整定位和超薄切片。为了能够观察到接近生活状态时的生物组织或细胞,要求取材速度越快越好。取完后立即使用固定剂固定,时间间隔越短越好,常用固定剂有四氧化锇固定液、戊二醛固定液和多聚甲醛固定液。为了去除残留的固定液,然后需要使用缓冲液对其进行漂洗,常用漂洗液为0.1 mol/L的磷酸缓冲液。由于大多数的包埋剂不溶于水,漂洗后的组织块,应使用脱水剂去除组织中的游离水,有利于包埋剂均匀渗入组织块内,常用的脱水剂有乙醇和丙酮。随后选择合适的包埋剂对其进行包埋使之具有良好的硬度和切割性能。也可以使用脱水剂来稀释包埋剂,以实现包埋剂取代脱水剂,这个过程就是渗透。包埋处理一般使用的是丙烯基类的树脂或环氧类的树脂。将包埋块修块定位好后就可以超薄切片了,此步骤需要使用到超薄切片机,其原理如图13所示。超薄切片机通过上下移动固定试样的臂,使样品通过金刚石刀进行切片,样品每上下运动一次就自动向前进一点。通常,水槽中装满水,连续切出的薄片都漂浮在水面上,最后用铜网捞出。Yamaoka等[63]采用TEM研究红色亚栖热菌H328的特征。其样品制备过程如下:提取,戊二醛固定液和磷酸钾缓冲液固定,不同浓度的乙醇溶液脱水,正丁基缩水甘油醚和812环氧树脂混合物浸润,随后转移至纯812环氧树脂包埋,再用金刚石刀切片(70 nm厚度),醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色,最后用TEM观察其形貌,结果如图14所示。

图13 超薄切片的示意图Fig.13 Schematic illustration of ultrathin slicing method

图14 红色亚栖热菌H328超薄切片的TEM图[63]Fig.14 TEM images of ultrathin sections of Meiothermus ruber H328[63]

采用超薄切片技术制样的聚合物样品和无机样品的操作步骤相对简单一些,一般情况下只需要通过包埋、修整定位和超薄切片就可以完成前期制样工作。Yang等[66]在研究嵌段共聚物微球时,为了清楚地观察其内部结构,先将样品包埋于环氧树脂中,然后固化,随后用在莱卡超薄切片机(UCT-GA-D/E-1/00, Germany)上用金刚石刀进行切片,其厚度控制在100 nm左右,再用300目的铜网捞出。最后用碘蒸气染色1 h以增加样品衬度。制备好的样品用透射电子显微镜观察,其结果如图15所示。

图15 PS133K-b-P2VP132K 微球横截面切片的TEM图[66]Fig.15 TEM images of the cross-sectional slices of PS133K-b-P2VP132K microspheres[66]

6 负染法

负染法主要用于制备病毒、细菌、细胞、生物大分子等TEM样品[67-71]。负染色又称为阴性反差染色,它主要是利用密度反差和静电场反差来提高样品的分辨力。生物样品的负染过程相对简便,先将样品制成悬浮液,随后采用悬滴法将其附着于载网上。具体方法如下:将悬浮液用毛细吸管或移液枪滴一滴附着于载网上,呈液珠状。静置数分钟再用滤纸的边角在液珠的边缘吸走多余的液体。然后滴上一种合适浓度的染液静置数分钟,样品不同染色时间差异很大。待染色结束自然风干后便可用透射电子显微镜观察。一般可选择的染色液有磷钨酸溶液、磷钨酸盐溶液和醋酸铀水溶液等。徐健[72]采用TEM观察丙烯酸酯乳液的微观结构之前,先将样品稀释150倍,再用磷钨酸进行染色,其TEM结果如图16所示,可以清晰地观察到样品为具有核壳结构的规整球形,内层白色为核层,外层灰色为壳层。Sahiro等[73]研究表明Preyssler型磷钨酸钾(K(15-n)[P5W30O110Mn+],M=Na+,Ca2+,Ce3+,Eu3+,Bi3+,Y3+)对病毒类样品是一种具有高性能的阴性染色试剂。图17所示为负染法的操作流程,先将病毒吸附于碳膜上,然后滴加含重金属元素的染色剂,过一定时间移走多余的染色液,自然干以后就能用于电镜观察。图18为T4噬菌体的TEM图,使用的是一种Preyssler型Eu3+包裹的K12[P5W30O110Eu(H2O)]染色剂,质量分数为0.3%的水溶液。

图16 MAA6乳胶粒的TEM图[72]Fig.16 TEM images of MAA6 emulsion particles [72]

图17 负染法[73]Fig.17 Negative staining method[73]

图18 T4噬菌体的TEM图[73]Fig.18 Transmission electron microscopy (TEM) images of T4 phages[73]

7 总结与展望

透射电子显微镜是一种研究物质微观形貌、显微结构以及微观成分的高端仪器,可以实现在原子尺度上对“加工处理-结构-性质”的关联性研究。因此,透射电子显微分析技术是科学研究过程中不可缺少的表征手段。然而,能否制备好透射电子显微镜样品是利用好该仪器的关键因素。对于不同类型的透射电子显微镜样品,应该采取不同的制样方法。这些方法可以总结为:超声分散法、双喷电解抛光法、离子减薄法、聚焦离子束技术、超薄切片技术以及负染法。对于粉末样品及大多数悬浮液,一般可以采用超声分散法制样;对于金属、陶瓷等块状样品,可以采用双喷电解抛光法、离子减薄法或者聚焦离子束技术中的一种或者几种结合的方式进行制样;对于一些特殊的有机薄膜样品以及生物试样等样品,可以采用超薄切片技术;只包含轻元素的生物样品则需采用负染法制样。不同样品的制样不仅仅选择的制样方法会有所不同,而且工艺参数也会不同。选择合适的制样方法及最佳参数将会大大提高透射电子显微镜的表征效果,更有利于推进科研工作。无损、高精度、高效率、自动化的制样技术将是未来透射电子显微镜制样设备发展的主要方向。