鸡干扰素基因刺激因子cDNA 克隆及生物信息学分析

2023-07-25黄秋楠亢守亭徐良腾周长明葛仕豪姜莉莉樊兆斌

中国畜禽种业 2023年6期

黄秋楠，亢守亭，徐良腾，周长明，王艳，葛仕豪，姜莉莉，樊兆斌*

（1.曹县畜牧服务中心，山东菏泽 274400；2.菏泽学院药学院，山东菏泽 274015；3.菏泽市禽免疫抑制病防控重点实验室，山东菏泽 274015）

先天免疫是宿主抵抗病原入侵的第一道防线，模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRS）激活宿主的先天免疫反应[1]。PRRs 被识别后，会触发信号，导致I 型干扰素（Type I interferon，IFN-I）、干扰刺激基因（Interferon-stimulated genes，ISGs）和炎症细胞因子的表达，促进适应性免疫反应[2]。干扰素基因刺激因子（Stimulator of Interferon Genes，STING）是天然免疫系统信号传导过程中重要的衔接蛋白[3,4]，主要位于内质网，介导异常的细胞质DNA 触发的免疫信号传导，对有效的先天免疫信号转导过程至关重要。STING 是天然免疫中重要的调节因子，作为连接病毒感应受体和干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor 3，IRF3）的适配器[5]，能诱导IRF3 和TANK 结合激酶(TANK Binding Kinase，TBK1)的磷酸化激活并调控Ⅰ型干扰素和干扰素刺激基因的表达，对病原入侵引起的天然免疫应答至关重要[6-8]。缺乏STING 的胚胎成纤维细胞限制RNA 病毒复制的能力降低[9]。目前针对哺乳动物STING 基因的研究较为广泛，对鸡STING 基因研究相对较少。该文旨在对鸡STING基因进行克隆和生物信息学分析，以期为STING编码蛋白的抗病毒功能及其在固有免疫信号通路中的深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

动物组织总RNA 提取试剂盒、FastQuant cDNA 第一链合成试剂盒、2×Taq PCR Mastermix、D 2000 Marker、质粒小提试剂盒、pGM-T、T4 DNA 连接酶等均购自天根生化科技（北京）有限公司；限制性内切酶EcoRI 与HindIII 购自宝日医学生物技术（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据GenBank 已发表的鸡STING 基因序列（KP893157.1），设计 STING 基因扩增引STING-F/STING-R，STING-F：TAGGAATTCATGCCCCAGGACCCGTCAACCAGGAG（EcoRI），STING-R：TAAAGCTTTCAGGGGCAGTCACTGCG（HindIII），引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.2 鸡STING 基因克隆及测序

提取鸡组织总RNA，反转录为cDNA，以其为模板，扩增鸡STING 基因。反应体系50μL：2×Taq PCR Mastermix 25μL，cDNA 1μL，上、下游引物各1μL，双蒸水22μL。PCR 程序：94℃5min；94℃30s，60℃45s，72℃80s，设35 个循环；72℃7min 后4℃保存。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。经胶回收试剂盒回收PCR 产物，16℃过夜连接pGM-T 载体，产物转化DH5α感受态细胞，接种LB（A+）平板，37℃过夜培养，挑取单个圆滑白色菌落，PCR 验证正确后送生工生物工程股份有限公司测序。

1.2.3 STING 基因序列分析

测序结果用NCBI 中BLAST 程序进行相似性比对；选取原鸡（Gallus gallus，KP893157.1）绿头鸭（Anas platyrhynchos，XM_027468121.2）、火鸡（Meleagris gallopavo，XM_010718794.3）、日本鹌鹑（Coturnix japonica，XM_015876253.2）、盔珠鸡（Numida meleagris，XM_021410148.1）、环颈雉（Phasianus colchicus，XM_031607086.1）、艾草松鸡（Centrocercus urophasianus，XM_04281 5288.1）、马（Equus caballus，XM_023617603.1）、牛（Bos taurus，KU695665.1）、绵羊（Ovis aries，XM_004008857.4）、羊驼（Lama glama，JQ359755.1）、人（Homo sapiens，MF622062.1）、小鼠（Mus musculus，NM_028261.1）、大鼠（Rattus norvegicus，NM_001109122.1）、家猫（Felis catus，KU315474.1）等物种，利用DNAStar 和Mega 5.0 软件进行STING 基因相似性比对并构建系统进化树。

1.2.4 STING 基因生物信息学分析

运用 ExPASy 在线软件 ProtParam 和Protscale 在线软件分析STING 基因编码蛋白的理化性质和亲疏水性；利用TMHMM2.0 在线软件对蛋白跨膜结构进行预测分析；用SignalP 5.0 预测蛋白信号肽，用PSORT II 分析蛋白的亚细胞定位；利用NetPhos3.1 Server，NetOGlyc 4.0 和NetNGlyc 1.0 进行潜在磷酸化位点及O、N 糖基化位点预测；利用SMART 程序推测蛋白质结构域；利用STRING 在线工具分析STING 互作蛋白，利用SOPMA 在线工具预测蛋白二级结构；利用SWISS-MODEL 预测蛋白三级结构。

2 结果

2.1 STING 基因CDs 区的克隆及序列分析

由图1 可知，PCR 产物经电泳检测，在1000bp 以上出现目的条带，与预期一致。应用DNAMAN 软件分析测序结果显示，STING 基因CDs 区为1140bp，与NCBI 上发表的原鸡STING基因序列同源性为99.9%，共编码379 个氨基酸，碱基组成分别为A（17.54%）、C（33.86%）、G（30.35%）、T（18.25%）。

图1 STING 基因扩增结果

2.2 STING 基因序列同源性分析及系统进化树构建

对Genbank 发表的不同物种STING 基因序列进行核苷酸同源性比对，结果显示白来航鸡STING 与原鸡同源性最高（99.9%）；环颈雉（92.3%）、火鸡（92.2%）、与盔珠鸡（91.9%）、艾草松鸡（91.1%）和日本鹌鹑（89.2%）同源性较高，与大鼠、小鼠、人、马、牛、绵羊等物种同源性较低（＜60%）。基于STING 基因的系统进化树分析结果表明，白来航鸡与艾草松鸡亲缘关系最近，与原鸡、火鸡、环颈雉、盔珠鸡、日本鹌鹑、绿头鸭等禽类形成1 个分支，人、小鼠、牛等哺乳动物形成另外1 个分支（图2）。

图2 鸡STING 基因系统进化树

2.3 STING 基因生物信息学分析

2.3.1 STING 编码蛋白理化性质、亲疏水性及跨膜结构预测分析

利用ExPASy 在线工具对STING 基因编码蛋白的理化性质预测结果表明，蛋白分子式为C1897H3032N530O541S22，理论分子量为42.6kD，理论等电点为6.67。编码379 个氨基酸，含量最多的氨基酸是亮氨酸Leu（L），所占比例均为17.2%，蛋白的不稳定系数为69.26，高于阈值40，提示该蛋白为不稳定蛋白。脂肪系数为105.01。平均亲水指数为-0.041。利用ExPASy程序ProtScale 对STING 编码蛋白亲/ 疏水性分析结果（图3）表明整条多肽链表现为亲水性。利用在线软件TMHMM2.0 进行跨膜区分析，结果（图4）表明该蛋白存在一个跨膜区。

图3 STING 蛋白亲/疏水性分析

图4 STING 蛋白跨膜结构预测

2.3.2 信号肽、亚细胞定位

利用SignalP 5.0 Server 在线软件对鸡STING信号肽进行预测，结果表明不含信号肽区域，说明该蛋白不是分泌型蛋白。用PSORT 程序分析STINGII 在线工具分析蛋白的亚细胞定位，结果显示STING 蛋白主要存在于内质网（55.6%），也存在于线粒体（22.2%）、高尔基体（11.1%）和细胞外基质（11.1%）。

2.3.3 磷酸化位点、糖基化位点预测

利用NetPhos 3.1 在线软件对STING 蛋白潜在磷酸化位点预测，结果显示，STING 蛋白中共存在33 个潜在的磷酸化位点，包括丝氨酸（S）磷酸化位点25 个、苏氨酸（T）磷酸化位点5 个和酪氨酸（Y）磷酸化位点3 个。经NetOGlyc 4.0在线软件分析结果显示，STING 蛋白存在潜在的O-糖基化点5 个。

2.3.4 STING 蛋白高级结构预测

STING 蛋白二级结构预测结果显示α-螺旋占比为54.62%，β-折叠占比为3.43%，延伸链占比为10.29%，无规则卷曲占比为31.66%。使用SWISS-MODEL 在线工具预测STING 蛋白三级结构，预测结果与二级结构预测结果基本一致（图5）。

图5 鸡STING 蛋白三级结构预测

2.3.5 蛋白相互作用分析

相互作用蛋白预测结果表明，STING 蛋白可能与TBK1、MAVS、IKBKE、MB21D1、IFIH1、TNFSF15、LACC1、DDX41 等蛋白存在相互作用（图6）。

3 讨论

先天免疫是宿主抵御病原体入侵的第一道也是最快速的防线。宿主细胞通过不同的模式识别受体（Pattern recognition receptor，PRR）识别保守的病原体结构，即病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和宿主损伤相关分子模式（Molecular patterns associated with host damage，DAMPs），启动先天免疫反应。在感知病毒感染过程中释放的PAMPs和DAMPs 后，信号级联被激活产生I 型干扰素和/ 或多种细胞因子和趋化因子，最终合成多种抗病毒蛋白[10]。STING 又称为跨膜蛋白173（Transmembrane protein 173，TMEM173），是宿主受病原入侵产生I 型干扰素反应的信号接头分子[11]。环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子（Cyclic guanylate adenylate synthase interferon gene stimulator，cGAS-STING）信号通路是内外源性异常核酸物质激活固有免疫系统的重要信号通路[12]，cGAS 可以感受胞质中双链DNA，催化ATP 和GTP 形成环二核苷酸（c GAMP）从而激活STING[13]。作为RIG-I 样受体（RIG-I-like receptors，RLRs）和cGAS-STING 信号通路中重要的衔接分子，STING 可激活核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）和干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor 3，IRF3）信号通路，诱导I 型干扰素和炎性因子分泌介导免疫反应，在炎症、感染和肿瘤发展中发挥重要作用[14,15]。STING 被认为是细胞内的传感器，在病毒感染时激活干扰素途径，介导宿主对病毒的防御[16]。STING 参与调控病毒的固有免疫应答，作为DENV、HCV、HCoV-NL63、PEDV 和SARSCoV 等病毒识别和拮抗的靶点，最终阻断IFN 途径[17]。过表达STING 可通过IRF3 和NF-κB 通路诱导IFN 反应，使ISG15 和内质网相关的干扰素诱导病毒抑制蛋白viperin 的表达上调，显著抑制H3N2 犬流感病毒复制[18]。冠状病毒木瓜蛋白酶通过破坏STING 介导的信号通路反向调控抗病毒先天免疫反应[19]。STING 的150 位赖氨酸被确定为RNF5泛素化的靶点，这导致了病毒感染后STING 的降解[20]。SARS-CoV-2 ORF9b 通过靶向RIG-I/MDA-5-MAVS、TLR3-TRIF 和cGAS-STING 信号通路的多个组分来拮抗I 型和Ⅲ型干扰素[21]。

与哺乳动物不同，鸡不存在RIG-I，但鸡STING 是病毒诱导的IFN 激活的关键中介物，鸡STING 在DF-1 细胞中的过表达会显著抑制NDV和AIV 的复制，并激活IRF-7 和NF-κB 诱导I型IFN 的表达[22]。鸡STING 作为先天免疫信号的重要调控因子，可能参与了鸡细胞内MDA5 信号通路[23]。蛋白相互作用预测结果表明STING 蛋白可能与TANK 结合激酶1（TANK binds kinase 1，TBK1）、线粒体抗病毒信号蛋白（Mitochondrial antiviral signaling proteins，MAVS）、B 细胞κ 轻肽基因增强子抑制因子（Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells，IKBKE）、含MAB21 域蛋白1（Contains MAB21 domain protein 1，MB21D1）、含干扰素诱导解旋酶C 域蛋白1（Contains interferon-induced helicase C domain protein 1，IFIH1）、重组人肿瘤坏死因子配体超家族成员15（Recombinant Human tumor necrosis factor ligand Superfamily member 15，TNFSF15）、含漆酶结构域1 蛋白（Containing laccase domain 1，LACC1）、DDX41 等蛋白存在相互作用。已有研究表明环鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）作为第二信使结合并激活STING，导致TBK1 磷酸化STING[24]。此外，STING 可能与自身免疫性疾病[25]、脂质代谢[26]和肿瘤发展[27,28]有关，因此对鸡STING 的深入探究为进一步探讨STING 在先天免疫中的生物学功能具有重要意义。