仔猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及耐药性检测

仁增旺姆

摘  要：为了了解海南藏族自治州共和县规模化猪场中仔猪副猪嗜血杆菌分离株的流行情况及对常用抗菌药的耐药情况。本试验于2022—2023年采集海南藏族自治州共和县规模化猪场中患疑似副猪嗜血杆菌病的仔猪鼻拭子、关节液、胸腔积液、肺脏等病料，共计283份。采用细菌分离鉴定、PCR方法对采集的病料进行副猪嗜血杆菌分离鉴定，采用人工感染小鼠试验验证分离株的致病性，采用纸片扩散法（Kirby-Bauer，简称K-B法）检测致病性副猪嗜血杆菌分离株对临床中常用抗菌药的耐药性。结果显示：从采集的283份病料中分离到128株副猪嗜血杆菌，通过致病试验显示，91株副猪嗜血杆菌能引起小鼠不同程度发病与死亡，为致病性菌株；分离的91株致病性副猪嗜血杆菌对磺胺间甲氧嘧啶、阿莫西林、氨苄西林等6种药物的耐药率为85.7％以上，对其他药物的耐药率为3.3％～25.3％，本研究为该地区仔猪副猪嗜血杆菌合理用药及防控提供参考。

关键词：仔猪；副猪嗜血杆菌；致病性；药敏试验

中图分类号：S855.1+2 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2023）03-0053-03

仔猪副猪嗜血杆菌病是由不同血清型的副猪嗜血杆菌引起的猪的一种传染性呼吸道疾病，也是养猪生产过程中常见的细菌性传染病之一。副猪嗜血杆菌可以通过不同的途径感染不同生产阶段的猪，仔猪最易感，感染率和死亡率均较高，尤其对4～8周龄的仔猪危害较厉害，仔猪感染后临床上的常見症状为纤维素性胸膜炎、呼吸困难和关节炎等，会给养猪业造成严重的经济损失[1-3]。相关研究表明，在养猪生产过程中，仔猪的副猪嗜血杆菌病经常与猪圆环病毒病、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等免疫抑制性病毒性疾病混合发生，加快发病动物的死亡，给临床诊断带来一定的困难[4-5]。

仔猪副猪嗜血杆菌病在世界不同国家的猪场广泛流行，已经成为多个国家和地区普遍流行的猪病之一，不同的国家与地区流行的仔猪副猪嗜血杆菌血清型具有差异性[6-7]。在临床上，仔猪副猪嗜血杆菌具有多种血清型，在疫苗制备上存在一定的困难，防控仔猪副猪嗜血杆菌病主要通过抗生素，随着抗菌药的广泛应用，已经产生严重的耐药性，给仔猪副猪嗜血杆菌病的临床治疗带来了一定的困难，给人类的健康也带来严重的危害[6]。

本试验于2022—2023年采集海南藏族自治州共和县规模化猪场中疑似患副猪嗜血杆菌病的仔猪鼻拭子、关节液、胸腔积液、肺脏等病料组织共计283份，对仔猪副猪嗜血杆菌进行分离鉴定，并分析其耐药性，以期对海南藏族自治州共和县仔猪副猪嗜血杆菌病的综合防控提供参考。

1  材料与方法

1.1 菌株来源

2022—2023年，从青海省海南藏族自治州共和县规模化猪场疑似患副猪嗜血杆菌病的仔猪上，采集鼻拭子、关节液、胸腔积液、肺脏等病料样本，共计283份。

1.2 细菌分离与培养

在无菌的条件下，将采集的各种样本接种于巧克力培养基，挑取巧克力培养基上单个的典型菌落接种于胰酪大豆胨 （tryptone soy broth，TSB）液体培养基中进行纯化培养，  37 ℃下震荡培养12～18 h，取菌液进行革兰染色镜检和生化特性鉴定。

1.3 细菌PCR鉴定

参照王同兆等[8]推荐的副猪嗜血杆菌鉴定引物，引物序列如下：F1：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3'；F2：5'- TACGGCTACCTTGTTTTG-3'，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。取纯化培养的副猪嗜血杆菌分离株，用水煮沸提取分离株的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板进行PCR鉴定。

1.4 致病性试验

参照王丽荣等[9]的方法，将临床上分离的副猪嗜血杆菌分离株接种于TSB液体培养基中，培养至对数生长期，调整菌液浓度至106 CFU/mL。攻毒组每株分离株腹腔注射2只昆明系小鼠，剂量为0.25 mL；对照组昆明系小鼠腹腔注射等量的无菌生理盐水。试验期为6 d，试验期间观察小鼠的发病情况，对死亡的小鼠进行细菌学鉴定。

1.5 药敏试验

纸片扩散法（Kirby-Bauer，简称K-B法）参照美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的要求对副猪嗜血杆菌分离株进行药敏试验和结果判定。

2  结果

2.1 细菌分离培养

疑似副猪嗜血杆菌的分离株在巧克力培养基上生长出圆形、隆起、整齐、表面光滑的灰白半透明的菌落；利用革兰染色镜检观察其形态学，发现分离株呈杆状、短杆状等多形性形态的革兰阴性菌，与报道的副猪嗜血杆菌培养特性及形态学基本上一致。生化特性鉴定结果显示，分离株为副猪嗜血杆菌。

2.2 细菌PCR鉴定

用PCR法对疑似副猪嗜血杆菌的分离株进一步鉴定。结果显示，临床上分离到的     128株疑似副猪嗜血杆菌的分离株均扩增出大约为320 bp的目的条带（图1）。对分离株的PCR产物进行测序，同源性比对显示，128株分离株均为副猪嗜血杆菌，分离率为45.2％（128/283）。

2.3 致病性试验

攻毒后2～4 d，攻毒组小鼠出现了精神沉郁、采食量减少、呼吸困难等不同的临床症状，个别小鼠死亡。死亡小鼠剖检可见肺脏、肝脏、肾脏、脾脏等脏器有不同程度的出血，并可分离得到副猪嗜血杆菌；对照组小鼠无临床症状健康存活。经统计，91株副猪嗜血杆菌能引起小鼠发病和死亡，为致病性副猪嗜血杆菌。

2.4 耐药性试验

用K-B法检测致病性副猪嗜血杆菌分离株对临床常用抗菌药耐药性分析，结果见表1。

由表1可知，分离的91株致病性副猪嗜血杆菌对临床中常用的药物具有不同的耐药性，其中对磺胺间甲氧嘧啶、阿莫西林、氨苄西林、多西环素等、恩诺沙星、环丙沙星6种药物的耐药率介于85.7％～98.9％，对头孢噻呋、头孢噻肟、头孢曲松、替米考星、氟苯尼考、多黏菌素、大观霉素、林可霉素8种药物的耐药率为3.3％～25.3％。

3  讨论

副猪嗜血杆菌为临床中常见的条件性致病菌之一，有多种血清型，广泛存在于自然的饲养环境（空气、粪便、污水）中，主要定植于猪的上呼吸道，可以通过多种途径（直接接触、空气、饲料和饮水等）在不同猪之间传播，当猪的免疫力下降时，容易引发副猪嗜血杆菌病[1]。副猪嗜血杆菌病为养猪生产中常见的传染性疾病之一，具有发病急、死亡率较高等特点，严重危害我国养殖业的发展[10]。近几年，关于仔猪副猪嗜血杆菌病的报道越来越多。本试验从采集的283份病料样本中分离到91株致病性副猪嗜血杆菌，说明副猪嗜血杆菌在该地区猪场中流行严重，应注意副猪嗜血杆菌病的疫苗接种与综合防控。药敏试验显示，分离的91株致病性副猪嗜血杆菌对磺胺间甲氧嘧啶、阿莫西林、氨苄西林等6种药物的耐药率为85.7％～98.9％，对其他被检药物耐药率为3.3％～25.3％。在临床上，在防治副猪嗜血杆菌病时应进行药敏试验，选用敏感的药物，并交替使用，同时应配合环境的消毒，提高其治疗效果。

参考文献

[1] 肖敏，刘建，卢昌，等．副猪嗜血杆菌的分离鉴定与灭活疫苗的初步研制[J]．动物医学进展，2022，43（8）：35-40.

[2] 赵自亮，田宇森，庄鸿琨，等．副猪嗜血杆菌与PCV3混合感染的实验室诊断及分析[J]．中国动物检疫，2022，39（12）：18-25.

[3] 范春梅．湖南省部分家庭猪场呼吸道疾病流行病学调查分析[J]．中国猪业，2020，15（5）：80-83.

[4] 杜炎斌，袁丽英，东笑，等．英德市某规模化猪场副猪嗜血杆菌分离鉴定及药敏试验[J]．动物医学进展，2022，43（6）：32-36.

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[6] 陈超群，陈佳莉，周萱仪，等．β-内酰胺类药物对副猪嗜血杆菌流行病学临界值的建立及耐药性的测定[J]．畜牧兽医学报，2021，52（11）：3234-3245.

[7] 王庆云．安阳地区副猪嗜血杆菌分离株的耐药性与耐药基因检测[J]．动物医学进展，2021，42（4）：131-134.

[8] 王同兆，张付贤，雷连成．1株副猪嗜血杆菌血清4型的分离鉴定及耐药性分析[J]．中国畜牧兽医，2022，49（3）：1096-1105.

[9] 王丽榮，董永军，张守平，等．副猪嗜血杆菌试验感染KM小鼠及在其体内的分布[J]．中国兽医杂志，2020，56（11）：43-46，122.

[10] 解金秋，马立孔，孙福方．某规模化猪场副猪嗜血杆菌分离鉴定及药敏试验[J]．中国猪业，2023，18（1）：76-78.