一种检测饲料中聚醚类抗生素的液相色谱-串联质谱方法

陈彤 钟名琴 邱永为 何玉榆 黄婷

摘  要：本研究基于液相色谱－串联质谱建立了一种高精密度检测饲料中聚醚类抗生素的方法，并对所建立的方法进行了方法学的考察与验证，参考已有的标准，对标准的相关处理步骤进行优化，采用液相色谱－串联质谱法进行分析。马杜霉素、莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的标准曲线相关系数分别为0.999 79、0.999 71、0.998 52、0.999 38，方法检出限分别为3.58 μg/kg、2.47 μg/kg、3.32 μg/kg、2.82 μg/kg，回收率范围为90.4％～101.5％、89.2％～102.0％、90.5％～101.0％、88.3％～103.0％，相对标准偏差为1.2％～1.3％、1.4％～2.2％、1.5％～3.2％、1.9％～3.8％。所得结果表明，该方法具有检出限低、回收率较好、精准度高、重复性好的优点，可以为检测饲料中聚醚类抗生素提供有力的方法支撑。

关键词：聚醚类抗生素；液相色谱－串联质谱；精密度；回收率

中图分类号：S859.84 文献标志码：A       文章编号：1001-0769（2023）03-0070-04

聚醚类抗生素（polyether antibiotics，PEs）是20世纪70年代发展起来的一类具有离子载体性质的抗生素，由链霉菌等微生物发酵产生，包括莫能菌素、马杜霉素、盐霉素和甲基盐霉素等，是一类被广泛应用于畜禽饲养行业中的广谱抗球虫药和促生长剂[1-3]。从化学结构上看，此类药物分子含有若干环状醚键，分子一侧带有羧基，故而容易与Na+、K+等离子结合形成多种金属盐，不溶于水，易溶于低级醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳及正己烷等有机溶剂，且在碱性或中性条件下稳定存在。它们能与球蟲细胞中的阳离子紧密结合，改变细胞膜上脂质屏障的渗透性，增加向球虫细胞内运输离子，为了平衡渗透压，大量水分进入球虫细胞内，导致球虫肿胀而死亡，因此也被称为离子载体类抗球虫药[4]。其对球虫子孢子第一代、第二代裂殖子有抑杀作用，同时又能有效促进动物的生长，提高畜禽产品的饲料利用率，提高养殖场经济效益，故被广泛添加于饲料中。但是，聚醚类抗生素本身在毒理学上属于高毒或剧毒物质，具有较强的细胞毒性，因此药物的安全范围非常窄。过量使用聚醚类抗生素容易导致其在动物产品中残留，并通过食物链在人体中蓄积，会严重危害人体健康。因此，研究聚醚类药物在饲料中残留量的检测技术，对保障畜禽产品质量安全有着重要的意义[5-6]。

如今，聚醚类抗生素的残留分析方法主要包括微生物检测法、免疫学法、分光光度法、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法等[7-9]。其中，高效液相色谱-串联质谱法将色谱的高分离能力与质谱的高灵敏度和高选择性优点相结合，不但对样本的前处理要求低，而且可以同时测定多种药物残留；该方法抗干扰能力强，灵敏度高，既可以完成对药物的定性，又可以达到定量的效果，减少了测定的时间，提高了检测质量，是一种非常优秀的测定多种聚醚类抗生素的方法。

本研究以农业部1862号公告-4-2012《饲料中5种聚醚类药物的测定液相色谱-串联质谱法》为基础，在保证检测结果准确可靠的前提下，优化了前处理的操作，并使用高效液相色谱-串联质谱法对饲料中的马杜霉素、莫能菌素、盐霉素以及甲基盐霉素进行定性定量检测，提高了检测效率，为聚醚类药物的检测提供有力的技术支持[10]。

1  材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

安捷伦1290液相色谱仪，AB Science质谱仪，氮吹仪，漩涡混合仪，电子天平，冷冻离心机，超纯水仪，超声波清洗机，硅胶固相萃取柱（500 mg/3 mL）。

1.1.2 药品与试剂

乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），正己烷，乙醚，二氯甲烷，甲酸（色谱纯）。

1.2 样本制备

用四分法称取适量饲料，经粉碎过40目孔筛，混匀后装入磨口瓶中备用。

1.3 标准工作液的配制

准确称取马杜霉素、莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的标准品，用甲醇分别配成1 000 μg/mL的标准储备液，－20 ℃保存备用，有效期12个月；分别移取适量的4种1 000 μg/mL的聚醚类标准储备液于同一容量瓶中，用甲醇稀释成100 μg/mL混合标准液，－20 ℃保存备用，有效期6个月；再移取100 μg/mL混合标准液稀释为                        10 μg/mL的混合标准工作液。

1.4 样本前处理

准确称取试样2.00 g（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加5 mL乙腈，涡旋10 min，超声提取20 min，9 000 r/min离心5 min，取上清液转移至另一个50 mL离心管。残渣用5 mL乙腈重复提取一次，合并两次上清液，取全部上清液于15 mL离心管中，40 ℃氮气吹干，加入3 mL正己烷溶解残渣，涡旋45 s，备用。

取硅胶固相萃取柱，加5 mL正已烷预洗，将备用液过柱，加乙醚-正己烷（体积比1∶1）10 mL，洗涤，抽干，加二氯甲烷-甲醇（体积比9∶1）5 mL洗脱，收集洗脱液，50 ℃下氮气吹干，用乙腈（含0.1％甲酸）1.0 mL溶解残渣，涡旋45 s后过0.22 μm滤膜，用于液相色谱-串联质谱法（liquid chromatograph mass spectrometer / mass spectrometer，LC-MS/MS）分析。

2  结果与讨论

2.1 标准曲线

按照农业部1862号公告-4-2012标准设置仪器参数，配制一系列浓度的标准样本溶液（10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、40.0 μg/kg、100 μg/kg、400 μg/kg），待仪器参数稳定后，对该系列标准样本溶液进行测定，绘制标准曲线，马杜霉素、莫能菌素、盐霉素及甲基盐霉素相关系数分别为0.999 79、0.999 71、0.998 52、0.999 38，具体见表1。

2.2 方法检出限确定

以空白饲料样本为基质，做7个平行添加试验，聚醚类药物（马杜霉素、莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素）的阳性添加浓度均为10.0 μg/kg，按照1.4方法进行前处理，然后上机测定，测得马杜霉素、莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素的方法检出限（method detection limit，MDL）分别为3.58 μg/kg、                                    2.47 μg/kg、3.32 μg/kg、2.82 μg/kg，具体见表1。计算公式如下：

方法检出限（μg/kg）＝k·Sb·C/X

式中k取3；Sb为平行测试样含量的标准偏差；C为加标浓度（μg/kg）；X为平行测试样含量的平均值。

2.3 回收率及精密度确定

以空白饲料样本为基质，向饲料样本中添加聚醚类药物（马杜霉素、莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素）浓度水平分别为10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、100 μg/kg进行加标回收试验。按照方法进行前处理，上机测试，结果如表2和表3所示。

根据表2与表3中相对标准偏差和回收率结果可发现，该方法的相对标准偏差较低，且回收率较好，马杜霉素、莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素的回收率范围分别为90.4％～101.5％、89.2％～102.0％、90.5％～101.0％、88.3％～103.0％，相对标准偏差分别为1.2％～1.3％、1.4％～2.2％、1.5％～3.2％、1.9％～3.8％。该方法的检出限较低、重复性较好，并且能保持较为理想的回收率，可用于马杜霉素、莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素的定性、定量检测。

3  结论

本研究旨在建立一种饲料中聚醚类抗生素的液相色谱-串联质谱的简便测定方法，为相关行业检测工作提供该类药物的检测方法及技术支持。结果表明，此方法前处理简单，精密度高而且稳定性好，较大地提高了实验整体的效率，适用于饲料中马杜霉素、莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素残留量的定性、定量检测。

参考文献

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[3] 薄海波，雒丽丽，曹彦忠，等．超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶和奶粉中6种聚醚类抗生素残留量[J]．分析化学，2009，16（8）：1161-1166.

[4] 刘素梅，张发旺，方忠意．超高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中5种聚醚类抗球虫药的含量[J]． 中国饲料，2009，1（17）：30-32.

[5] 丁燕玲，刘国华，吴雯娟，等．超高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中聚醚类抗生素残留[J]．广东化工，2020，47（19）：160-162.

[6] 陈明，耿志明，王冉，等．饲料中聚醚类抗生素的柱后衍生同时测定方法研究[J]．中国饲料，2005，30（20）：27-28，31.

[7] 杨露，谭会泽，刘松柏，等．禽饲料中5种聚醚类抗球虫药物检测方法研究[J]．粮食与饲料工业，2021，22（1）：59-61.

[8] 贾涛．液相色谱-串联质谱法检测鸡用饲料中聚醚类药的方法研究[J]．饲料广角，2016，23（2）：12-15.

[9] 刘佳佳，佘永新，刘洪斌，等．聚醚类抗生素残留检测技术及其研究进展[J]．食品工业科技，2011，32（8）：440-444，448.

[10] 中華人民共和国农业农村部．饲料中5种聚醚类药物的测定 液相色谱-串联质谱法[S]．北京：中国农业出版社，2012.