猪细小病毒S-1A株对细胞的适应性及其培养条件的优化

朱永军 张婉华 林鸷 何锡忠 彭丽英

摘  要：将猪细小病毒S-1A株在不同的细胞中培养，测定病毒含量，以确定适合猪细小病毒S-1A株增殖的细胞。结果表明：猪细小病毒S-1A株能在猪肾传代细胞系（PK-15）、猪肾原代细胞（PK）、猪睾丸细胞（ST）和仔猪肾细胞（IBRS-2）中生长增殖，不能在幼仓鼠肾细胞系（BHK-21）、绿猴肾细胞（Vero）和鸡胚成纤维细胞（CEF）中增殖；当ST细胞生长至2/3单层时，将猪细小病毒S-1A株种毒液100倍或1 000倍稀释后接种ST细胞，37 ℃培养96～144 h，获得的病毒载量最高。

关键词：猪细小病毒S-1A株；ST细胞；培养条件

中图分类号：S816.79 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2023）03-0041-04

猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一[1]。1966年，Mayr在进行猪瘟病毒组织培养时首次发现PPV，通过核酸鉴定证明为DNA病毒[2]。猪细小病毒病的主要特征是怀孕母猪发生流产、死产、胚胎死亡和胎儿木乃伊化，而母猪本身不表现临床症状，其他猪感染后也无明显的临床症状[3-4]。

猪细小病毒能在猪的细胞（包括猪睾丸细胞、猪肾原代细胞及传代细胞系）和人的某些传代细胞系中培养增殖[1]，适合在正处于有丝分裂期的细胞内增殖。细胞感染猪细小病毒后初期呈现弥漫性颗粒样病变，随后细胞圆缩、拉网、脱落。1982年，上海市农业科学院畜牧兽医研究所用仔猪肾原代细胞从上海郊区某猪场所产的死胎中分离到一株PPV，将其在细胞上连续传代、纯化，获得一株具有良好的免疫原性的PPV强毒株，命名为PPVS-1A株。本研究将PPVS-1A株在不同的细胞内培养，以获得一种适合该病毒的细胞，并优化其培养条件。

1  试验材料

1.1 细胞与病毒

猪肾传代细胞系（PK-l5）、猪睾丸细胞（ST）、仔猪肾细胞（IBRS-2）、绿猴肾细胞（Vero）、幼仓鼠肾传代细胞系（BHK-21），均由本实验室保存。猪肾原代细胞（PK）、鸡胚成纤维细胞（CEF），均由本实验室按常规方法制备。

PPVS-1A株由本实验室分离鉴定、传代并保存。

1.2 培养基

DMEM培养基、新生牛血清，购自GIBCO公司；胰酶购自Sigma公司。

细胞生长液为含10％新生牛血清的DMEM培养基。细胞维持液为含2％新生牛血清的DMEM培养基。

2  试验方法

2.1 细胞接种

按常规方法培养或制备PK-15、BHK-21、IBRS-2、PK、ST、Vero和CEF细胞单层。用PPVS-1A株病毒液接种细胞，置37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，每天观察细胞病变效应并记录。当细胞病变效应达75％以上时，收获细胞培养物，并测定病毒含量；没有细胞病变效应的细胞均于接毒后7 d收获，－70 ℃冻融3次后传代，盲传3代，每代均观察有无细胞病变效应。

2.2 病毒含量测定

用细胞生长液将种毒液作10倍系列稀释，4个稀释度10－4、10－5、10－6、10－7 ，分别接种有丝分裂期的相应细胞（96孔细胞培养板），每个稀释度接种4孔，每孔0.1 mL，同时设细胞阴性对照孔，接种后，置37 ℃、5％ CO2培养箱中培养5～7 d，每天观察细胞病变效应，测定病毒半数组织培养感染剂量（50％ tissue culture infectious dose，TCID50）。

2.3 血凝试验

在96孔板的第1孔至第12孔，每孔加入磷酸盐缓冲液（0.01 M，pH＝7.4）0.05 mL，取被检样品0.05 mL，从第1孔起，依次作   2倍系列稀释，至最后一个孔，每孔加入0.5％豚鼠红细胞悬液0.05 mL，并设红细胞对照孔，摇匀，置25～28 ℃作用35～45 min后觀察结果，并记录。

2.4 最佳接毒剂量的确定

将PPVS-1A株种毒液分别稀释10倍、100倍、1 000倍、10 000倍后接种ST细胞，观察细胞病变效应。当75％以上的细胞出现细胞病变效应时收获细胞毒液，－70 ℃反复冻融3次，分别测定TCID50。TCID50最高的接毒剂量为最佳接毒剂量，且血凝效价大于1∶1 024。

2.5 最佳接毒时间的确定

分别采用病毒与ST细胞同步接种、形成2/3细胞单层接种及形成良好单层接种这三种方法来接种PPVS-1A株病毒液，37 ℃培养。当75％以上的细胞出现细胞病变效应时收获细胞毒液，－70 ℃反复冻融3次，分别测定TCID50。TCID50最高的接毒时间为最佳接毒时间，且血凝效价大于1∶1 024。

2.6 最佳收毒时间的确定

将PPVS-1A株病毒液接种ST细胞，分别于37 ℃培养60 h、72 h、84 h、96 h、120 h、144 h后收获细胞毒液，－70 ℃反复冻融3次后，分别测定其病毒含量（TCID50），以TCID50最高者的收毒时间为最佳收毒时间，且血凝效价大于1∶1 024。

3  试验结果

3.1 细胞适应性结果

将PPVS-1A株病毒液接种PK-15、PK、ST、IBRS-2细胞，第1代细胞均出现细胞病变效应，主要表现为细胞圆缩、拉网、脱落，当细胞病变效应达到75％以上时收获细胞培养物。接种BHK-21、Vero和CEF细胞均未出现细胞病变效应，盲传3代也未有细胞病变效应。

3.2 病毒含量测定结果

取上述细胞培养物，冻融3次后接种同种细胞，计算病毒含量。ST细胞增殖的病毒含量为107.50 TCID50/mL；PK-15细胞增殖的病毒含量为107.25 TCID50/mL；PK细胞增殖的病毒含量为107.00 TCID50/mL；IBRS-2细胞增殖的病毒含量为106.25 TCID50/mL；其他几种细胞接种后均未出现细胞病变效应，盲传3代的原代培养物均未测出PPVS-1A株病毒。

3.3 最佳接毒剂量

试验结果显示，种毒液稀释10倍后接种细胞，收获细胞时测得的病毒含量为106.00～106.25 TCID50/mL；种毒液稀释100倍后接种细胞，收获细胞时测得的病毒含量为107.00～107.50 TCID50/mL，且血凝效价均大于1∶1 024；种毒液稀释1 000倍后接种细胞，收获细胞时测得的病毒含量为107.00～    107.50 TCID50/mL，且血凝效价大于1∶1 024；种毒液稀释10 000倍后接种细胞，收获细胞时测得的病毒含量为106.00～106.75 TCID50/mL。试验表明，最佳接毒剂量为种毒液稀释100或1 000倍。详见表1。

3.4 最佳接毒时间

结果显示，细胞形成2/3单层时接种病毒，病毒含量最高，且血凝效价大于1∶1 024。其次是同步接种，最后是形成良好单层时接种。试验表明，细胞形成2/3单层时接种PPVS-1A株最佳。详见表2。

3.5 最佳收毒时间

结果表明，接毒后96～144 h收毒，细胞病变效应可达75％以上，病毒含量在107.25 TCID50/mL以上，且血凝效价大于1∶ 1 024。详见表3。

4  讨论

本研究对细胞适应性得出的结果与Bergeron等[5]、Cartwright等[6]和Wu等[7]国内外学者的研究结果相似，结果表明，PPVS-1A株能在PK-15、PK、ST和IBRS-2等猪源细胞中增殖，不能在BHK-21、Vero和CEF细胞中增殖。PK细胞是原代细胞，制备繁琐且原材料来源受限；IBRS-2细胞增殖的病毒含量较低；PK-15细胞增殖的病毒含量较高，但PK-15细胞易于污染猪圆环病毒；ST细胞为传代细胞系，细胞形态好，生长快，易于培养，增殖的病毒含量较高。因此，本研究选用ST细胞系来增殖PPVS-1A株。

根据试验结果，PPVS-1A株在ST细胞系上的最佳培养条件为：在细胞形成2/3单层时接种培养，种毒液稀释100倍或1 000倍后接种，置37 ℃培养96～144 h。

赵润泽等[8]和赵文影等[9]对河南、北京、江苏、安徽等地区PPV流行情况进行调查，结果显示2021年的PPV核酸检出率比2020年的明显升高，说明目前猪细小病毒病已普遍存在于猪群中，给养猪业造成了巨大的经济损失。本研究对PPVS-1A株的细胞适应性和在ST细胞系上的最佳培养条件的研究为猪细小病毒病疫苗的研发提供了基础。

参考文献

[1] 殷震，刘景华．动物病毒学[M]．２版．北京：科学出版社，1997．

[2] MAYR A，MAHNEL H．Cultivation of hog cholera virus in pig kidney cultures with cytopathogenic effect[J]．Zentralbl Bakteriol Originate，1964，195（2）：157-166．

[3] STRECK A F，TRUYEN U． Porcine Parvovirus[J]．Current Issues in Molecular Biology，2020，37：33-46．

[4] MENGELING W L，LAGER K M，VORWALD A C．The effect of porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus on porcine reproductive performance[J]．Animal Reproduction Science，2000（60/61）：199-210．

[5] BERGERON J，HEBERT B，TIJSSEN P．Genome organization of the Kresse strain of porcine parvovirus： identification of the allotropic determinant and comparison with those of NADL-2 and field isolates[J]．Journal of Virology，1996，70（4）：2508-2515．

[6] CARTWRIGHT S F，LUCAS M，HUCK R A．A small haemagglutinating porcine DNA virus. I. Isolation and properties[J]．Journal of Comparative Pathology，1969，79（3）：371-377．

[7] WU Y F，ZHU L，XU Z W，et al．Proliferation characteristics of a PK-15 cell-adapted strain of porcine parvovirus[J]．Bing Du Xue Bao，2013，29（4）：357-363．

[8] 趙润泽，同珂，李文静，等．湖北地区猪细小病毒流行病学调查[J]．安徽农业科学，2021，49（8）：83-85．

[9] 赵文影，张云静，白小飞，等．猪细小病毒BJ2株的分离鉴定及全基因组序列分析[J]．河南农业科学，2023，52（2）：136-144．