高效液相色谱法测定雀辣中辣椒素及类似物的含量

白铭松，何佳艳，熊彩云，袁 潘，李成功，潘文丽

（祥云县综合检验检测院，云南大理 671000）

雀辣资源主要分布于云南普洱地区、西双版纳地区和德宏地区。雀辣在普洱地区主要分布于宁洱县黎明乡、磨黑镇把边江流域和勐野江流域，当地人称其为雀屎辣。顾晓振等[1]研究证实了雀辣更倾向于灌木辣椒（Capsicum frutescens）。辣椒素和二氢辣椒素是辣椒中的主要生物活性成分，已有研究证实辣椒素具有抗氧化、预防心血管疾病、保护胃肠黏膜和抗肿瘤等多种功效[2-10]，今后可从提取辣椒素及类似物的途径发展到医药等领域的应用和研究。

辣椒素的含量可使用液相色谱法[11-12]、气相色谱法[13]、液相色谱质谱联用法[14-15]等方法进行测定，但目前鲜有雀辣中辣椒素及二氢辣椒素分析检测的报道。本文建立和优化了雀辣中辣椒素和二氢辣椒素的含量测定方法，并对普洱雀辣和西双版纳雀辣中辣椒素及二氢辣椒素的含量进行分析比较，为雀辣产业的发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

普洱雀辣采购于云南宁洱县黎明乡，西双版纳雀辣购于云南西双版纳（所有样品经烘干后备用）；辣椒素（成都曼思特生物科技有限公司，纯度为98.61%）；二氢辣椒素（Stanford Chemicals，纯度为99.11%）；电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司，GZX-GF-101）；分析天平（梅特勒，ME204T）；高效液相色谱仪（赛默飞，UItimate 3000）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

方法一：取样品约0.5 g，分别加入10 mL、5 mL、5 mL 70%乙醇溶液超声提取3次，每次提取20 min，合并提取液，混匀后直接过0.45 μm滤膜，待测定。方法二：称取样品约1 g，分别加入20 mL、15 mL、15 mL 50%乙醇溶液超声提取3次，每次提取20 min，合并提取液，精确量取20 mL于蒸发皿中蒸至近干，加甲醇溶解并转移至5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀后过0.22 μm滤膜，待测定。

1.2.2 标准溶液的配制

分别称取辣椒素、二氢辣椒素0.019 45 g、0.015 89 g（精密称定），用甲醇溶解并稀释定容至10 mL，得到浓度为1.92 mg·mL-1的辣椒素和浓度为1.57 mg·mL-1的二氢辣椒素储备溶液。分别准确吸取辣椒素、二氢辣椒素储备溶液0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL、0.05 mL和0.10 mL于10 mL容量瓶中并用甲醇定容至刻度，配成辣椒素浓度为0.019 2 mg·mL-1、0.038 4 mg·mL-1、0.076 7 mg·mL-1、0.095 9 mg·mL-1和0.191 8 mg·mL-1，二氢辣椒素浓度为0.015 7 mg·mL-1、0.031 5 mg·mL-1、0.063 0 mg·mL-1、0.0787 4 mg·mL-1和0.157 5 mg·mL-1的混合标准使用液。

1.2.3 色谱条件

Acclaim™ 120 C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；流动相：甲醇+1%磷酸水（80+20），等度洗脱；检测波长：280 nm。

2 结果与分析

2.1 样品前处理的优化结果

对混合标准使用液及不同前处理方法得到的样品提取液进行检测分析。用辣椒素和二氢辣椒素标准物质的保留时间进行定性；使用外标多点校准法，以峰面积进行定量。辣椒素和二氢辣椒素的测定结果见表1。两种前处理方法检测结果无显著差异（P＞0.05），即不同的样品处理方法对雀辣辣椒素和二氢辣椒素含量的检测结果没有太大的影响。但第一种方法操作简便，所用试剂较少，故采用方法一进行方法确认并对不同产地雀辣中二氢辣椒素和辣椒素的含量进行测定。

表1 不同提取方法的辣椒素、二氢辣椒素含量（单位：mg·g-1）

2.2 方法的确认

2.2.1 线性及相关系数

将配制的混合标准使用液上机分析，以浓度为横坐标，目标峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。辣椒素标准曲线为Y=71.856X+0.356 4，相关系数大于0.999 9，表明辣椒素在0.019 2～0.191 8 mg·mL-1线性良好。二氢辣椒素标准曲线为Y=101.2X+0.557 6，相关系数为0.999 8，表明二氢辣椒素在0.015 7～0.157 5 mg·mL-1线性良好。

2.2.2 方法检出限和定量限

使用同一浓度的标准溶液进仪器多次测定，选取目标峰后较为平直的一段（9～10 min）作为噪音基线，得到化合物的信噪比（S/N）。根据GB/T 27417—2017中5.4.2.2信噪比法评估检出限（LOD），并默认信噪比与浓度呈正比，计算化合物的仪器检出浓度（信噪比为3）和仪器定量浓度（信噪比为10），得到样品中化合物的实际检出限与定量限。

由表2可知，辣椒素的检出限为5.84 mg·kg-1，定量限为19.46 mg·kg-1，二氢辣椒素检出限为4.68 mg·kg-1，定量限为15.61 mg·kg-1。从已知的资料可知[11-12,16-17]，辣椒中辣椒素和二氢辣椒素的含量远高于所建立方法的检出限和定量限，因此可以推广应用于其他品种辣椒中辣椒素及二氢辣椒素的含量测定。

表2 辣椒素和二氢辣椒素的检出限和定量限

2.2.3 方法准确度

按照定量限、2倍定量限、10倍定量限加入对照品，按照方法一进行前处理，上机分析，扣除样品本底值后得到回收率。辣椒中辣椒素及二氢辣椒素在低加标浓度时的回收率分别为91.23%、91.06%，在中加标浓度时的回收率分别为94.85%、93.33%，在高加标浓度时的回收率分别为101.22%、99.58%。实验结果表明该方法准确度高，准确度满足相关标准对回收率的要求。

2.2.4 方法精密度

称取约0.5 g的试样6份，按照方法一进行前处理，分别进样测定。辣椒素测定结果为3.221 mg·g-1、3.215 mg·g-1、3.173 mg·g-1、3.177 mg·g-1、3.217 mg·g-1和3.171 mg·g-1，精密度为0.8%。二氢辣椒素测定结果为0.848 mg·g-1、0.886 mg·g-1、0.851 mg·g-1、0.854 mg·g-1、0.889 mg·g-1和0.869 mg·g-1，精密度为2.1%。该方法精密度良好，满足相关标准对方法精密度的要求。

2.3 不同产地雀辣中辣椒素和二氢辣椒素含量

使用方法一对成熟度一致的2份西双版纳雀辣、2份普洱雀辣进行处理，上机检测分析。根据辣椒素和二氢辣椒素的峰面积求出样品中辣椒素、二氢辣椒素的含量，结果见表3。普洱雀辣的辣椒素及二氢辣椒素的含量均明显高于西双版纳雀辣。有研究表明辣椒中辣椒素及二氢辣椒素的含量与辣椒的品种、成熟度、地理环境等因素有关，成善汉等[18]的研究结果表明，印度超级辣椒的辣椒素含量最高达59.86 mg·g-1；吴奕敏等[17]研究了小米辣的辣椒素含量为（0.050±0.004）～（8.966±0.306）mg·g-1，二氢辣椒素含量为（0.003±0.002）～（1.311±0.055）mg·g-1；MENICHINI等[13]研究了辣椒未成熟阶段辣椒素含量为（1 071±16.7）μg·g-1，成熟阶段辣椒素含量为（4 363±23.1）μg·g-1。有研究发现雀辣中还含有维生素C等营养物质，较其他品种的辣椒含量更高[16]，故雀辣具有明显的研究开发价值。

表3 不同产地雀辣的辣椒素和二氢辣椒素含量（单位：mg·g-1）

3 结论

使用该方法测定雀辣中辣椒素及二氢辣椒素，辣椒素在0.019 2～0.191 8 mg·mL-1线性良好，相关系数大于0.999 9，二氢辣椒素在0.015 7～0.157 5 mg·mL-1线性良好，相关系数为0.999 8；方法回收率为91.06%～101.22%，RSD为0.8%～2.1%。优化后的提取方法快速、稳定、准确、节省溶剂，方法适用于测定雀辣中辣椒素和二氢辣椒素的含量。雀辣中辣椒素含量为（3.190±0.025）～（5.308±0.022）mg·g-1，二氢辣椒素含量为（0.868±0.021）～（1.082±0.018）mg·g-1，普洱雀辣中辣椒素及二氢辣椒素的含量高于西双版纳雀辣。