放大内镜结合VEGF、CD34及CD105等血管生成分子检测在早期食管癌诊断中的价值

邱敏霞,陈文妹,孔灿灿,毛苇

食管癌是临床常见的消化道恶性肿瘤之一,严重威胁国民健康。临床上通过内镜联合病理活检进行食管癌患者诊断,但单纯内镜检查敏感度低,而病理活检时间长、具有有创性,给患者和临床诊疗造成诸多不便[1]。多项研究表明,结合血清标志物检测对于食管癌早期诊断具有积极意义。本研究拟通过比较不同食管病变的放大内镜日本食管学会(Japanese Esophageal Society,JES)分型和血清血管生成相关分子血管内皮生长因子(VEGF)、CD34和CD105表达,以内镜下活检或手术的病理诊断为金标准,探讨放大染色内镜联合血管生成相关分子检测在早期食管癌及癌前病变诊断中的应用价值。进一步将放大内镜检测联合血清标志物构建可视化列线图,方便临床实践,以期为食管癌早筛早诊提供新的方法,实现早期针对性干预治疗,进而提高相关患者的生活生命质量,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2022年1月—2022年12月海南省人民医院内镜诊疗中心检出可疑早期食管癌或癌前病变患者152例,男89例,女63例,年龄36～79岁,中位年龄59岁。入组患者主要临床症状为胸骨后不适、疼痛和吞咽哽噎感;44例患者既往诊断“慢性胃炎”“食管炎”和“反流性食管炎”等且接受过抑酸治疗;53例患者有吸烟史或饮酒史;本研究经医院伦理委员会审批同意[伦理号(2022)375号],患者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①18岁以上;②常规内镜下见可疑病变,主要包括食管黏膜缺失、溃疡、糜烂、表面粗糙、充血、隆起,黏膜缺失,或伴有黏膜血管纹理异常改变,可疑癌前病变或早癌的患者[2];③无合并其他器官来源肿瘤;④临床病历资料完整。(2)排除标准:①既往诊断食管癌或同时伴有其他系统来源肿瘤;②胃肠道出血、凝血功能异常或近1周有阿司匹林、华法林等抗凝药物服用史的患者;③妊娠或者哺乳期女性;④未接受病理活检,或病理结果无法明确其良恶性。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 早期食管癌病变放大染色内镜及组织病理学检查:术前禁食水8～10 h,检查开始前20～30 min盐酸达克罗宁胶浆[3]口服,祛除上消化道内泡沫后表面麻醉,而后予丙泊酚(1.0～2.0 mg/kg)静脉麻醉。首先,使用放大染色内镜白光模式观察整个食管,记录异常病变位置、大小、形态等;然后切换至窄带光谱成像(NBI)模式,边退镜边观察食管黏膜、血管情况,仔细观察并记录食管可疑病变位置的黏膜变化和血管形态;进一步通过NBI联合放大内镜,观察病变部位的上皮乳头内毛细血管袢(IPCL)形态,根据JES的AB分型系统,记录IPCL的形态[4]并评估病变性质;最后行卢戈碘染色并记录不染区和淡染区的部位、大小、范围等[5],并对病变部位进行组织病理学检查。

1.3.2 血清VEGF、CD34和CD105表达水平检测:收集患者术前全血5 ml,离心留取上层血清,-80℃保存备用。VEGF ELISA试剂盒购自碧云天公司,货号为PV963;CD34和CD105 ELISA试剂盒购自上海沪震生物,货号分别为HZ-CD34-Hu、HZ-ENG/CD105-Hu。从4℃冰箱中取出ELISA试剂盒中标准品(重组蛋白或者单价的小分子,用于定量分析)离心,利用倍比稀释法根据标准说明进行检测,采用1∶100比例对生物素标记抗体和辣根过氧化物酶亲和素进行稀释,并置于室温备用[6]。每孔加生物素标记抗体100 μl,37℃温育1 h,弃去孔内液体、甩干、洗板;每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μl,室温放置1 h,弃去孔内液体,甩干,洗板;依序每孔加底物溶液90 μl,37℃避光显色15～30 min,使用酶标仪(Multiskan FC,赛默飞)在450 nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)[6],计算VEGF、CD34和CD105表达水平。

1.3.3 组织活检及病理标准:内镜下留取活检组织及内镜黏膜下剥离术(ESD) 切除标本,首先经过10%甲醛固定,并于24 h内病理科送检。病理结果的诊断标准执行“维也纳分级标准”[4]。根据组织病理学检查将食管病变分为炎性反应、轻度不典型增生、重度不典型增生和食管早癌;其中重度不典型增生属于高级别上皮内瘤变,轻—中度不典型增生属于低级别上皮内瘤变。

2 结 果

2.1 早期食管癌病变的放大染色内镜及组织病理学检查 患者均经内镜下活检或术后病理明确诊断,其中炎性反应34例,轻度不典型增生27例,重度不典型增生28例,早期食管癌63例。放大内镜观察病变部位的IPCL形态JES-AB分型,其典型形态见图1。放大内镜下JES分型:A型80例(早癌11例);B1型51例(早癌36例);B2型14例(早癌10例);B3型7例(早癌6例),见表1。组织病理诊断是食管早癌的金标准,本研究中利用放大内镜观察JES-AB分型诊断食管早癌的敏感度为0.730、特异度为0.663。

注:A.A型,IPCL轻度扩张,多见于食管炎性反应;B.B1型,IPCL扩张和延长,多见于轻—中度不典型增生;C.B2型,IPCL扩张和蛇形,多见于重度不典型增生;D.B3型,IPCL扩张、扭曲和不规则变形,多见于早癌。图1 放大内镜检查对食管毛细血管袢进行JES分型(卢戈碘染色,×80)Fig.1 JES typing of esophageal capillary loops by magnifying endoscopy (Lugo iodine staining, × 80)

表1 不同JES分型中早癌与非癌(炎性反应和轻/重度不典型增生)所占比例 [例(%)]Tab.1 Proportion of early cancer and non cancer (inflammatory response and mild/severe atypical hyperplasia) in different JES subtypes

2.2 不同食管病变患者血清VEGF、CD34和CD105等标志物水平比较 血清VEGF、CD34和CD105在炎性反应、轻度不典型增生、重度不典型增生及食管早癌的患者中水平依次升高,差异均有统计学意义(P<0.01),见表2。

表2 不同食管病变患者血清VEGF、CD34和CD105水平比较Tab.2 Comparison of Serum VEGF, CD34, and CD105 Levels in Patients with Different Esophageal Lesions

2.3 放大内镜检查联合血清标志物诊断早期食管癌列线图模型构建 为便于临床实践,笔者构建了基于放大内镜JES分型联合血清标志物VEGF、CD34和CD105的食管早癌诊断模型。该模型纳入的指标包括性别、年龄、JES分型、血清VEGF、CD34和CD105水平,通过列线图可方便查找各指标对应的单指标评分,进一步将各单指标评分相加得到总评分,进而找到其对应食管早癌可能性,见图2,若食管病变患者的列线图总评分>400分,则该患者为食管癌的可能性超过90%;若总评分<150分,则其患食管癌的可能性仅为10%。

图2 放大内镜检查联合血清标志物诊断食管早癌列线图模型构建Fig.2 Construction of a nomogram model for the diagnosis of early esophageal cancer using magnifying endoscopy combined with serum markers

2.4 列线图模型和各血清标志物诊断食管早癌价值分析 绘制列线图模型和血清VEGF、CD34、CD105诊断食管早癌价值的ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示,列线图模型和血清VEGF、CD34、CD105诊断食管早癌的AUC分别为0.922、0.821、0.772和0.687,列线图模型诊断食管早癌价值较大,见表3、图3。

图3 列线图模型和各血清标志物诊断食管早癌的ROC曲线Fig.3 Receiver operating characteristic of nomogram model and serum markers in diagnosis of early esophageal cancer

表3 列线图模型和各血清标志物诊断食管早癌的价值比较Tab.3 Comparison of the diagnostic value of the column chart model and various serum markers for early esophageal cancer

3 讨 论

食管癌是全球肿瘤发病率第8位,病死率第6位的恶性肿瘤[7]。我国是食管癌高发国家,尤其在农村高发,食管癌仍是严重威胁居民生活质量的疾病。食管癌患者具有早期症状隐匿、易漏诊、中晚期治疗困难、预后差的特点[8-9]。因此,对食管癌高危人群筛查和早期诊断和治疗干预对改善患者预后具有重要意义。本研究通过比较不同食管病变的放大内镜JES分型和血清血管生成相关分子(VEGF、CD34和CD105)表达,探讨放大染色内镜联合血管生成相关分子检测在早期食管癌及癌前病变诊断中的应用价值。

随着内镜检查发展,内镜对早期食管癌的诊断具有重要价值。其中放大内镜检查增加了黏膜上皮、黏膜凹窝以及黏膜下血管的对比度和清晰度,可以更清楚地观察食管黏膜的细微结构,在早期食管癌诊断中的价值日益突出。研究显示,普通内镜诊断食管早癌的准确度约为60%,放大内镜诊断食管早癌的敏感度为70%～90%[10-11],受限于医师经验水平和样本量不同而略有差异。本研究中单纯放大内镜检查评估食管早癌的敏感度为0.830,特异度为0.763,与既往研究一致。

VEGF又称血管通透因子,具有增加血管通透性、细胞外基质变性、促进血管内皮细胞迁移、增殖和促进新生血管形成的作用,在炎性反应、损伤修复以及肿瘤发生发展中具有重要调节作用[12-13]。VEGF可促进肿瘤新生血管生成,促进肿瘤增殖、转移,其水平升高与患者预后差显著相关[14-16]。通过使用贝伐珠单抗等抗血管生成药物,可抑制机体VEGF水平,抑制肿瘤新生血管生成,在包括食管癌在内的多种肿瘤中均具有显著抑制作用[17-18]。本研究中食管早癌患者血清VEGF水平显著高于食管炎性反应以及轻重度不典型增生患者,同样提示VEGF可能与食管癌发生发展相关。

CD34是一种高度糖基化的细胞表面抗原,在成熟的血管内皮细胞上广泛表达,可促进炎性细胞的运输,介导白细胞聚集并穿越血管内皮细胞向炎性反应部位移行,启动炎性反应,并协同趋化因子增强炎性反应[19-20]。此外,CD34参与细胞的信号识别和增殖迁移,是创伤愈合、凝血、炎性反应及肿瘤侵袭转移等生理病理过程的分子基础[21]。CD105是透明带蛋白家族的跨膜糖蛋白,在炎性反应、伤口愈合及肿瘤等血管生成增加的组织中表达显著增加[22-23]。本研究食管早癌患者血清CD34、CD105水平均显著高于非癌患者,提示CD34和CD105与食管癌发生发展潜在相关,且可用于食管癌辅助诊断,但是诊断准确度与放大内镜JES分型相当,略低于血清VEGF水平。

为进一步提高食管早癌诊断准确性,本研究进一步将放大内镜检测联合血清标志物构建可视化列线图,该列线图模型具有最高的诊断准确性,高于放大内镜JES分型和VEGF、CD34和CD105等血清标志物。该模型纳入指标易于临床获取,便于临床实践,有望提高食管癌早筛早诊准确性,实现早期针对性干预治疗,进而提高相关患者的生活生命质量。尽管本研究综合分析放大内镜联合血管生成相关分子标志物在食管早癌中的诊断价值,建立了更为准确的列线图模型。但本研究的血清学指标仅为内镜检查前的单次血样结果,缺少对患者长时间的动态评估。此外,本研究为单中心数据,样本量尚需要进一步补充,该模型尚需要其他中心的独立数据进行验证,以增加其临床应用价值。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

邱敏霞:设计研究方案,实施研究过程,分析试验数据,论文撰写、统计学分析;陈文妹、孔灿灿:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;毛苇:提出研究思路,论文审核