山莓叶中总黄酮提取工艺优化的试验研究

李丹，程天印

（1.邵阳职业技术学院生物工程系，湖南 邵阳 422000；2.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128）

山莓（Rubus corchorifolius L.F.）为属蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属（Rubus. L）植物，在我国分布广泛，其野生资源尤以长江流域最为丰富[1]。据《本草纲目》《名医别录》《食疗本草》《本草拾遗》等多部古籍记载，山莓的根、茎、叶、果实均可入药，且用药部位不同，药效也有所差异[2,3]。根据有关研究表明，山莓叶中含有多种有效成分，本实验拟以山莓叶中总黄酮为研究对象，对其提取工艺进行探讨和优化，为下一步研究大孔树脂富集山莓叶总黄酮工艺打好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

芦丁标准品、无水乙醇（C2H5OH,A.R）、亚硝酸钠（NaNO2，A.R）、硝酸铝（Al（NO3）3，A.R）A.R、氢氧化钠（NaOH，A.R）。

1.1.2 主要仪器

JY98-3D 超声波细胞粉碎机、旋转蒸发仪、恒温水浴锅、UV-VIS 分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 总黄酮的测定方法

采用Al(NO3)3络合分光光度法，应用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH 反应体系，用不加NaNO2的样品液作空白对照溶液。

1.2.2 乙醇回流提取山莓叶黄酮

1.2.2.1 乙醇浓度对山莓叶黄酮得率的影响

精确称量干山莓叶粉末6 份，每份2.00 g，在60℃温度下，按1∶20 的固液比，分别以40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇浓度回流提取山莓叶粉末1 h，重复提取一次，合并提取液至100mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，分别测定这6 份提取物中的山莓叶黄酮含量。

1.2.2.2 固液比对山莓叶黄酮得率的影响

精确称量取干山莓叶粉末4 份，每份2.00g，在60℃的温度下，用80%浓度的乙醇分别以1∶5、1∶10、1∶20、1∶40 的固液比回流提取山莓叶粉末1 h，重复提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，分别测定这4 份不同固液比提取物中的山莓叶黄酮含量。

1.2.2.3 提取温度对山莓叶黄酮得率的影响

精确称量干山莓叶粉末4 份，每份2.00 g，用80%浓度的乙醇、1∶10 的固液比，分别在50℃、65℃、80℃、95℃的温度下回流提取山莓叶粉末1 h，重复提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，分别测定不同回流提取温度下4 份提取物中的山莓叶黄酮含量。

1.2.2.4 提取时间对山莓叶黄酮得率的影响

精确称量干山莓叶粉末4 份，每份2.00 g，在80℃温度下，用80%浓度的乙醇以1∶10 的固液比，分别回流提取山莓叶粉末1、2、3、4 h，重复提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，分别测定这4 份不同回流提取时间的提取物中山莓叶黄酮的含量。

1.2.2.5 回流提取正交试验

分别精确称量干山莓叶粉末2.00 g，在上述单因素实验基础上，对影响提取得率的乙醇浓度、固液比、提取温度、提取时间四因素三水平进行正交试验，运用L9(34)正交表筛选山莓叶黄酮回流提取的最佳工艺。

1.2.3 超声波提取山莓叶黄酮

1.2.3.1 超声时间的选择

精确称量山莓叶粉末5 份，每份2.00 g，在40℃温度下，用80%浓度的乙醇、以1∶25 的固液比超声提取山莓叶粉末5、15、25、35、45 min，重复提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，分别测定这5 份不同超声提取时间的提取物中山莓叶黄酮的含量。

1.2.3.2 固液比的影响

精确称量山莓叶粉末6 份，每份2.00 g，在40℃温度下，用80%浓度的乙醇分别以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 的固液比超声提取山莓叶粉末35 min，重复提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，分别测定这6 份提取物中山莓叶黄酮的含量

1.2.3.3 乙醇浓度的影响

精确称量山莓叶粉末5 份，每份2.00 g，在40℃温度下，按1∶25 的固液比，分别用50%、60%、70%、80%、90%浓度的乙醇超声提取山莓叶粉末35 min，重复提取一次，合并提取液至100 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，分别测定这5 份提取物中山莓叶黄酮的含量。

1.2.3.4 温度的影响

精确称量山莓叶粉末5 份，每份2.00g，用80%浓度的乙醇以1∶25 的固液比，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的温度下超声提取山莓叶粉末35 min，重复提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，分别测定这5 份提取物中山莓叶黄酮的含量。

1.2.3.5 超声提取正交试验

分别精确称量干山莓叶粉末2.00 g，在上述单因素实验基础上，对影响提取得率的提取时间、固液比、乙醇浓度、温度四因素三水平进行正交试验，运用L9(34)正交表筛选山莓叶黄酮超声波提取的最佳工艺。

图1 不同乙醇浓度回流提取对山莓叶黄酮得率的影响

1.2.4 正交试验数据处理

数据分析采用统计软件SPSS 13.0 进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 乙醇回流提取山莓叶黄酮

2.1.1 乙醇浓度对黄酮得率的影响

在60℃温度下，按1∶20 的固液比，分别以40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇浓度回流提取山莓叶粉末1 h，重复提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，分别测定各提取物中的黄酮含量。

图2 不同固液比回流提取对山莓叶黄酮得率的影响

从图1 可以看出，在固料比、提取温度、提取时间均相同的条件下，乙醇浓度与山莓叶黄酮得率成正比，山莓叶黄酮浸出率随乙醇浓度升高而升高，但当乙醇浓度超过80%以后，山莓叶黄酮得率增加不明显。

2.1.2 固液比对黄酮得率的影响

图3 不同温度回流提取对山莓叶黄酮得率的影响

用80%浓度乙醇分别以1∶5、1∶10、1∶20、1∶40 的固液比回流提取山莓叶粉末1 h，重复提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，分别测定这4 份不同固液比提取物中的山莓叶黄酮含量。

从图2 中可以看出，当固液比在1∶5 到1∶10 之间时，随着固液比的增加，黄酮提取率增加明显，但超过1∶10 之后，黄酮的提取率增加缓慢。

2.1.3 回流提取温度对黄酮得率的影响

用80%浓度的乙醇与山莓叶粉末以1∶10 的固液比，分别在50℃、65℃、80℃、95℃的温度下回流提取1 h，重复提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，分别测定这4 份不同温度提取物中的山莓叶黄酮含量。

试验显示，在50℃～80℃时，黄酮得率随温度的升高而明显增加，但提取温度为95℃时，黄酮得率低于在80℃时的提取率，故选择80℃为最佳提取温度。

2.1.4 回流提取时间对黄酮得率的影响

在80℃温度下，用80%浓度的乙醇与山莓叶粉末以1∶10 的固液比，分别回流提取1、2、3、4 h，重复提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，分别测定这4 份不同回流提取时间的提取物中山莓叶黄酮的含量。结果见图4。

试验结果表明，提取时间为3 h 时，山莓叶黄酮得率最高，延长提取时间黄酮得率反而降低。

2.1.5 回流提取正交试验结果与分析

图4 不同时间回流提取对山莓叶黄酮得率的影响

根据上述单因素实验，对影响回流提取山莓叶黄酮得率的乙醇浓度、固液比、提取温度、提取时间4 个因素进行四因素三水平正交实验设计，运用SPSS 13.0 数据分析软件进行分析。结果见表1。

由表2 的结果可知，山莓叶黄酮回流提取最佳的提取工艺条件为A3B2C3D3。由极差大小确定主次因素为A＞D＞B＞C，即乙醇浓度＞提取时间＞固液比＞提取温度。对各因素进行多重比较发现：70%、80%、90%三个浓度的乙醇在提取率上呈现极显著差异，提取效果最佳的乙醇浓度为90%；提取时间上，提取4 小时得率高于前两者；固液比以1：10 时效果最好；提取温度以95℃为最佳。

2.2 超声波提取山莓叶黄酮

2.2.1 超声时间的选择

表1 乙醇回流提取因素水平表

表2 L9(34)正交试验结果

在40℃温度下，用80%浓度的乙醇、以1∶25的固液比分别超声提取5、15、25、35、45 min，重复提取一次，合并两次提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，分别测定这5 份不同超声提取时间的提取物中山莓叶黄酮的含量。

表3 方差分析表

由图5 可以看出，在其他提取条件相同的情况下，山莓叶黄酮得率随着超声时间的增加而增加，但超过35 min 后增加不明显，故超声时间选择35 min。

图5 超声时间对山莓叶黄酮得率的影响

2.2.2 固液比的选择

用80%浓度的乙醇分别以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 的固液比超声提取山莓叶粉末35 min，重复提取一次，合并提取液至100mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，分别测定这6 份提取物中山莓叶黄酮的含量。

从图6 可知，乙醇浓度、提取温度、提取时间等提取条件相同的情况下，山莓叶黄酮得率随固液比增大（液体体积增大）而提高，而当固液比增大到1∶25 时，山莓叶黄酮得率提高不再明显，故固液比选择1∶25。

图6 不同固液比超声提取对山莓叶黄酮得率的影响

2.2.3 乙醇浓度的选择

在40℃温度下，按1∶25 的固液比，分别用50%、60%、70%、80%、90%浓度的乙醇超声提取山莓叶粉末35 min，重复提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，分别测定这5 份提取物中山莓叶黄酮的含量，结果见图7。

由图7 看出，在其他提取条件相同的情况下，山莓叶黄酮提取得率随乙醇浓度增大而提高，当乙醇浓度达到80%后则提高不再明显，故选择80%的乙醇浓度为最佳超声提取浓度。

2.2.4 超声温度的选择

用80%浓度的乙醇以1∶25 的固液比，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的温度下超声提取山莓叶粉末35 min，重复提取一次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻度线，分别测定这5 份提取物中山莓叶黄酮的含量，结果见图8。

图7 不同乙醇浓度超声提取对山莓叶黄酮得率的影响

图8 不同温度超声提取对山莓叶黄酮得率的影响

表4 乙醇超声提取因素水平表

由上表可以看出，山莓叶黄酮的提取率随着温度升高而提高，达到40℃后黄酮提取率提高不明显，且温度过高可破坏黄酮结构，故选择40℃为最佳提取温度。

表5 正交试验结果

表6 方差分析表

2.2.5 正交试验结果与分析

根据上述单因素实验，对影响超声波提取山莓叶黄酮得率的4 个因素：超声时间、固液比、乙醇浓度和超声温度进行四因素三水平正交实验设计，运用SPSS13.0 数据分析软件进行分析。结果见表4。

由表5 的结果可知，山莓叶黄酮超声波提取的最佳工艺条件为A3B2C3D3。由极差大小确定主次因素为A＞C＞B＞D，即超声时间＞乙醇浓度＞固液比＞超声温度。对各因素进行多重比较发现：超声时间对黄酮提取得率有极显著影响，35 分钟时超声提取得率最好；用1∶20 的固液比提取得率要极显著优于1∶15 和1∶25；70%、80%、90%三个乙醇浓度中90%的浓度提取得率最高；超声温度对提取效果的影响最小，50℃时提取效果最好。

3 讨论

本试验选用乙醇为提取剂，对山莓叶总黄酮进行提取。单因素考察显示：（1）受乙醇浓度的影响，山莓叶黄酮得率随乙醇浓度增大而提高，超过一定浓度后则黄酮得率提高不明显，因此需选择适当的提取剂浓度，既能满足提取得率较高，又不浪费试剂。（2）受固液比的影响，山莓叶粉末与乙醇提取液的固液比增大黄酮得率也随之升高，但超过一定值后黄酮得率增加不明显，究其原因概为当固液比达到一定比例后，溶剂已将黄酮类物质充分溶出，再增大固液比提取得率亦不会有太大变化。从节约成本出发，也避免溶剂用量过大而导致浓缩时间延长，提取应选择适当的固液比。（3）受提取温度的影响，山莓黄酮得率会随提取温度升高而提高，但温度超过一定值后得率不升反降，究其原因为，黄酮类物质会随溶液温度升高而提高分子无规则热运动，加速从细胞中溶出，因此在提取过程中增加温度有利于黄酮物质的提取。但同时，其他杂质溶出率也会随着温度的升高而也增大，且过高的温度会氧化破坏黄酮类物质，从而影响黄酮得率。（4）受提取时间的影响，按照一般规律，浸提的时间越久浸提会越完全，但杂质的浸出也会同时增加，再加上黄酮类物质在高温下性质不稳定，如果处于高温状态下过久反而使其因被氧化而得率下降。

为确定最佳提取条件，本试验还根据单因素试验对影响黄酮得率的因素进行正交试验设计，分别确定了回流提取和超声波提取的最佳工艺条件：用95%的乙醇在95℃下以1∶10 的固液比加热回流提取4 h；用90%的乙醇在50℃下以1∶20 的固液比超声提取35 min。

对比加热回流提取法和超声波提取法的优缺点，本试验发现：在提取溶剂用量上，加热回流提取法比超声波提取法所需提取溶剂少，得率也略高于超声波提取法；在提取时间上，超声波提取法占优势，且操作较简便；在设备上，回流提取法所用设备简单，容易普及，且影响因素少[4-6]。两种提取方法各有所长，也各有不足，在应用中可结合实际情况选择适宜的方法。