适配体功能化二氧化钛基复合光催化剂选择性降解黄曲霉毒素B1作用研究

李佳骏,孙淑敏,杨佳毅,谢岩黎

河南工业大学 粮油食品学院 河南省粮油食品安全检测与控制重点实验室,河南 郑州 450001

TiO2光催化降解是一种新型高级氧化技术,主要利用光催化剂在太阳光下生成空穴与电子,电子与水或氧反应生成超氧自由基或羟基自由基,通过自由基反应将有机物降解为小分子化合物、CO2和H2O等[5],具有操作简便、无二次污染、可直接利用太阳光、降解彻底、运行成本低等优点。但单一的TiO2量子效率和可见光活性较低,常通过掺杂、半导体复合、表面光敏化等方式提高TiO2光催化材料的催化活性[6],其中与磁性石墨烯(MGO)的复合备受关注。MGO不仅具有优异的导电性、较好的磁性,且具有较大的比表面积,这些优点利于反应物在TiO2表面聚集,提高TiO2中的光生电子和光生空穴的传输速率且降低TiO2的禁带宽度[7],从而显著增强光催化效率和可见光活性,通过外部磁力也解决了复合材料难分离的现象。但是,MGO/TiO2光催化剂自身选择性和专一性较差,在复杂的食品基质体系中,可能会引起有机组分的改变或破坏。此外,普通的光催化材料因缺少特异性,导致体系中较低浓度的反应物往往在竞争中处于劣势而不能被有效降解[8]。因此,可通过在光催化材料表面修饰能与目标污染物特异性作用的基团,实现对低浓度目标物的选择性优先降解。

核酸适配体(Aptamer)作为一种新型分子识别元件,被誉为 “人工抗体”,是近年来研究的热点之一[9]。适配体在亲和力高、特异性强的基础上还具有可人工合成、成本低、稳定性好、靶分子广泛、易修饰等众多优势,已在疾病检测、新药研发、化学分析、食品安全等多个领域广泛应用[10-11]。目前,核酸适配体在真菌毒素领域的应用主要集中于分析检测方面,已开发出一系列基于核酸适配体的AFB1检测方法[12-13]。此外,还有研究报道利用适配体修饰固相载体(硅、琼脂糖、聚苯乙烯等)作为固相萃取的吸附剂或制备适配体亲和色谱,对食品、环境和生物研究中小分子污染物进行目标性富集与净化[14-15]。基于此思路,作者利用核酸适配体对光催化材料进行功能化修饰,通过与适配体的特异性结合作用,实现混合体系中AFB1的选择性降解,并增强低浓度目标物的降解效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

AFB1标品:美国Sigma公司;氧化石墨烯:深圳市图灵进化科技有限公司; 钛酸四丁酯、正己烷、异丙醇、无水乙醇:天津科密欧化学试剂有限公司;甲醇、乙腈:色谱级,天津四友化学品有限公司;N-羟基琥酰亚胺磺酸钠盐(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC):麦克林生化科技有限公司;试验用水均为超纯水。

氨基修饰的荧光标记AFB1适配体序列:(5′-NH2-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-FAM -3′(NH2-aptamer-FAM)[16],由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并纯化。

1.2 仪器与设备

250 W 高压汞灯:上海亚明照明有限公司;KH-100水热反应釜:上海弘瑞仪器设备有限公司;CL8R离心机:湘仪离心机仪器有限公司;Gemini 300扫描电子显微镜:德国Carl Zeiss公司;ALPHA傅里叶红外光谱仪:德国Bruker公司;HS3120 超声波清洗机:北京天地普和有限公司;1290( FLD 检测器)高效液相色谱仪:美国Agilent公司;TalosF200x透射电子显微镜:美国FEI公司。

1.3 试验方法

1.3.1 MGO/TiO2-aptamer 复合材料的制备

参照课题组前期所使用的方法制备磁性氧化石墨烯复合二氧化钛材料(MGO/TiO2)[17]。将MGO/TiO2(2 mg/mL)悬浮液超声1 h,加入NaOH(150 mg)和氯乙酸(100 mg),超声12 h。使用10 mol/L 的NHS和EDC对MGO/TiO2表面羧基进行活化处理后用纯净水冲洗,其中EDC与NHS溶液体积比为1∶2.5。将20 μL核酸适配体(NH2-aptamer-FAM)探针溶液(1.0 μmol/L )加入500 μL 活化后的MGO/TiO2悬浮液中,振荡10 min,加入50 μL 20 mmol/L Tris-HCl溶液,室温反应60 min。反应结束后,用磷酸缓冲液(pH 7.4)洗涤,去除没有结合的适配体。最后,用超滤膜(10 kDa)过滤并冷冻干燥[18],获得MGO/TiO2-aptamer粉末。

1.3.2 MGO/TiO2-aptamer 复合材料的表征

采用扫描电子显微镜对MGO/TiO2-aptamer的微观构造以及表面形态进行分析。采用红外光谱仪对样品的傅里叶红外光谱进行分析。采用透射电镜对核酸适配体功能化MGO/TiO2材料的元素组成进行分析。

1.3.3 AFB1的 HPLC 色谱检测条件

液相色谱柱:C18( Welch,XB-C18,4. 6 mm ×250 mm×5 μm);进样量10 μL,柱温40 ℃,流速0.8 mL/min;流动相:V( 0.1%甲酸水)∶V(乙腈) = 55∶45;荧光检测器激发波长设为360 nm,发射波长设为440 nm。

1.3.4 MGO/TiO2-aptamer对AFB1降解增强作用研究

设置 AFB1标准溶液质量浓度组:低浓度组(0.5 μg/mL)、中等浓度组(1.0 μg/mL)和高浓度组(2.5 μg/mL),分别用适配体功能化MGO/TiO2、未修饰的MGO/TiO2各6 mg进行光催化试验,采用高压汞灯进行光照,并间隔30 min取样,6 000 r/min离心3 min,然后取上清液过0.22 μm有机系滤头,使用HPLC测定样液中的AFB1含量。

1.3.5 MGO/TiO2-aptamer对AFB1降解选择性研究

分别取相同质量浓度的AFB1、DON(2.5 μg/mL)各150 μL配制成混合毒素溶液,加入 MGO/TiO2-aptamer与未修饰的MGO/TiO2各6 mg进行光催化试验,方法同1.3.4,使用HPLC分别测定样品中的 AFB1和DON含量。

1.3.6 不同因素对 MGO/TiO2-aptamer光催化降解AFB1的影响

将10 mL AFB1标准溶液(2.5 μg/mL)和一定量的MGO/TiO2-aptame加入光催化反应装置中,方法同1.3.4,使用HPLC测定样液中的AFB1含量。平行3次试验,考察适配体浓度( 1、2、4 μmol/L)、催化剂用量( 4、6、8、10 mg)、降解时间(0、30、60、90、120、150 min)及溶液 pH 值(1、3、5、7)对AFB1降解作用的影响。

1.3.7 MGO/TiO2-aptamer 对AFB1光催化降解动力学行为分析

分别称取6 mg MGO/TiO2-aptamer,再用甲醇配制质量浓度为0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL的 AFB1标准溶液10 mL备用,加入光催化剂材料后按照1.3.4中的方法进行试验,使用HPLC测定AFB1含量,平行3次试验,模拟MGO/TiO2-aptamer对AFB1光催化降解动力学行为。光催化反应的动力学行为使用 Langmuir-Hinshelwood(L-H)动力学表达式进行分析,简化模型方程:

ln(C0/C)=kKt=Kat,

式中:C0为AFB1标准溶液的初始质量浓度,μg/mL;C为t时刻的质量浓度,μg/mL;k和K分别为理论一级速率常数和表面吸附平衡常数,mL/μg;Ka为表观速率常数,min-1;t为反应时间,min。

1.4 数据处理与分析

使用SPSS 25.0 进行数据分析,使用Origin 2022制图。

2 结果与分析

2.1 MGO/TiO2-aptamer 复合材料的表征

图1(a)和(b)为MGO/TiO2和MGO/TiO2-aptamer复合材料的SEM图。图1(a)表明,不规则的球形颗粒TiO2与Fe3O4发生了一定程度的聚集,并相对均匀地分散在片层MGO上。由图1(b)可知,核酸适配体功能化MGO/TiO2的过程使TiO2在MGO表面分散得更加均匀,可能是环氧基与羟基的羧基化过程中大量的超声导致,且没有破坏复合材料的基本形貌。

注: (a) MGO/TiO2微观形貌; (b) MGO/TiO2-aptamer微观形貌; (c) 两种复合材料FTIR光谱; (d)-1复合光催化剂全部元素映射图、(d)-2核酸适配体特有磷元素映射图、(d)-3核酸适配体特有氮元素映射图。

注:内插图为不同光催化材料降解0.5 μg/mL AFB1的效果。

如图1(c)所示,MGO/TiO2-aptamer复合材料和MGO/TiO2的FTIR光谱在3 455 cm-1处的宽峰可归因于O—H的伸缩振动[19];广泛的Ti—O—Ti与Ti—O—C键吸收峰出现在500 cm-1与1 634 cm-1左右,表明TiO2已成功负载到MGO上[20]。此外,MGO/TiO2-aptamer材料在1 240～1 500 cm-1有明显的伸缩振动峰,归因于适配体的碱基,而2 927 cm-1附近的弱吸收峰归因于CO—NH[21],证明MGO/TiO2上的羧基与适配体上的氨基键合成功,得到MGO/TiO2-aptamer材料。用元素映射图谱进一步表征,由图1(d)可知,MGO/TiO2-aptamer具有Ti、Fe等元素,证明MGO/TiO2材料制备成功;具有核酸适配体特有的N、P元素,进一步证明MGO/TiO2-aptamer制备成功。

2.2 MGO/TiO2-aptamer对AFB1降解增强作用及特异性分析

图 2 显示了MGO/TiO2-aptamer对低、中、高浓度组AFB1标准溶液的降解效果,结果表明适配体功能化MGO/TiO2后对AFB1的降解率均高于未经适配体修饰的材料(P<0.05)。MGO/TiO2-aptamer对初始质量浓度为0.5 μg/mL的AFB1标准溶液降解增强效果最明显,降解率提高约15.2%。从而可以证明适配体对MGO/TiO2材料的功能化可以有效提高对低浓度毒素的降解效果。

由图3可知,分别向AFB1与DON混合毒素溶液中加入MGO/TiO2与MGO/TiO2-aptamer 后,MGO/TiO2对AFB1及DON降解率无明显差别,分别为71.6%、66.4%,但MGO/TiO2-aptamer对AFB1及DON降解率差异明显,分别为87.1%、38.6%,核酸适配体功能化的MGO/TiO2对AFB1具有更好的降解效果,而对DON的降解率明显下降,从而验证适配体功能化MGO/TiO2对AFB1具有选择性降解效果。

图3 MGO/TiO2-aptamer 对 AFB1 的特异性降解

2.3 不同因素对MGO/TiO2-aptamer光催化降解AFB1的影响

如图4(a)所示,不同浓度的适配体功能化MGO/TiO2对AFB1光催化降解率均高于MGO/TiO2,尤其在前30 min的降解时间内,AFB1降解率迅速升高,表明适配体的功能化加快了对目标物的捕捉和降解进程;当适配体浓度为1 μmol/L时,其复合材料对AFB1的降解率一直保持最高,随着适配体浓度增加,降解率反而有所下降,这可能是因为过多的适配体会占据更多活性位点,使复合材料接受光照能力变弱。综上考虑,选取后续试验所用适配体浓度为1 μmol/L。

图4 不同因素对MGO/TiO2-aptamer光催化降解AFB1的影响

如图4(b)所示,降解前30 min降解率陡增,AFB1被催化剂表面的活性位点以及适配体捕捉;降解时间延长至60 min 时,由于催化剂表面空白活性位点数目减少降解率增加缓慢;当降解时间达到120 min,降解趋势整体变平缓,表明光降解过程接近于平衡状态。此外,AFB1的降解率随催化剂用量的增加而增加,当催化剂用量6 mg、降解时间120 min时,降解率达到98.3%,再增加催化剂的用量,AFB1的降解率反而有所下降,过多的催化剂会导致反应体系透光率下降,抑制催化剂对光子的吸收。因此,选择光催化剂添加量6 mg、光照时间120 min作为优化降解条件。当催化剂用量为6 mg时,MGO/TiO2-aptamer 对AFB1的降解率(98.3%)与 MGO/TiO2(85.7%)相比显著增强,再次表明适配体功能化可明显加快光催化反应的进程,提升光催化降解效率。

如图4(c)所示,由于强碱性溶液对 AFB1结构有破坏作用使其迅速分解,因此主要考虑在pH≤7条件下对 AFB1降解效果的影响。光催化剂在酸性溶液中的降解率明显高于中性溶液的降解率。当pH 3且光照时间120 min时,降解率已高达97.6%,而此时在中性溶液中降解率仅为77.2%,表明酸性环境有助于加快光催化降解AFB1的进程。可能是因为在酸性条件下,溶液中H+含量较高,促使化学平衡朝着正方向进行,有利于生成具有强氧化作用的 H2O2和·OH,进而提高了AFB1的光催化降解[22]。

2.4 MGO/TiO2-aptamer光催化降解AFB1的动力学行为分析

MGO/TiO2-aptamer 对不同初始质量浓度的 AFB1降解情况如图5所示。随着光照时间的增加,不同质量浓度标准溶液的降解率均呈逐步增高的趋势,初始质量浓度2.5 μg/mL的AFB1标准溶液降解率最高,达98.3%。但AFB1标准溶液中毒素含量过高时,因无法满足降解反应体系中所需氧化自由基活性位点,使降解效果变差。

图5 MGO/TiO2-aptamer 对不同初始质量浓度 AFB1 的光催化降解

图 6(a)模拟了MGO/TiO2-aptamer光催化降解 AFB1的动力学行为。结果表明,3种初始质量浓度条件下AFB1标准溶液的ln(C0/C) 与反应时间t存在良好的线性关系(R2≥0.98),MGO/TiO2-aptamer光催化降解AFB1的过程符合一级动力学反应规律,且AFB1标准溶液的降解速率随着初始质量浓度的增加从0.033 9 min-1降低至0.006 5 min-1,可能是因为MGO/TiO2-aptamer的用量不变时,其活性位点总量和表面积是不变的,若毒素含量提高,反应过程中产生的更多中间产物会附着在光催化剂晶体表面,光催化剂的处理负荷也就越大从而影响对AFB1的捕捉,导致降解速率减小。同时,由图6(b)可以看出,通过适配体功能化后的材料降解速率由0.012 9 min-1提高至0.033 9 min-1,提高约2.6倍,再次验证了适配体功能化MGO/TiO2对于AFB1的降解增强效果。

图6 不同初始质量浓度 AFB1 及不同材料光催化降解动力学模型

3 结论

利用核酸适配体对磁性氧化石墨烯复合二氧化钛光催化材料进行选择性修饰,成功合成光催化复合材料MGO/TiO2-aptamer。使用SEM、TEM以及FTIR对两种光催化剂进行表征,结果表明TiO2与Fe3O4颗粒相对均匀地附着在MGO片层表面,核酸适配体对于MGO/TiO2的功能化过程并没有破坏其表面微观结构,且适配体的骨架、碱基以及CO—NH键特征峰均在FTIR中表现明显,通过TEM 元素映射图谱可以发现Ti、Fe元素以及核酸适配体特有的N、P元素,证明MGO/TiO2-aptamer制备成功。与未修饰的 MGO/TiO2材料相比,MGO/TiO2-aptamer对低质量浓度AFB1和混合毒素中AFB1的降解率显著提高,验证了其对低质量浓度毒素的降解增强效果以及选择性降解性能。在优化条件下,当MGO/TiO2-aptamer添加量6 mg,在pH 3的环境中使用紫外可见光照射120 min后,AFB1降解率可达98.3%,且AFB1的光催化降解遵循 Langmuir-Hinshelwood 准一级动力学模型。本研究为制造选择性降解食品中AFB1的光催化材料提供了新思路,后续需进一步研究光催化过程的降解作用机制、主要活性物质以及材料重复使用效果。