小麦中玉米赤霉烯酮高灵敏智能POCT技术研究

王 丹,胡小风,王 督,唐晓倩,姜 俊,李培武,张兆威*

1.中国农业科学院油料作物研究所,湖北 武汉 430062

2.湖北洪山实验室,湖北 武汉 430070

3.西藏大学 生态环境学院,西藏 拉萨 850000

4.农业农村部生物毒素检测重点实验室, 农业农村部油料产品质量安全风险评估实验室(武汉), 国家农业检测基准实验室(生物毒素),湖北 武汉 430062

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是真菌产生的有毒代谢产物。小麦是一种重要的农作物,也是受ZEN污染的主要粮食作物之一。全世界范围内均有ZEN污染报道,我国对粮食和饲料中ZEN污染调查分析显示阳性检出率可达100%[1]。

ZEN具有非类固醇雌激素作用,影响生殖细胞分化,破坏细胞内遗传物质,甚至引起动物死亡[2]。食用含有ZEN的小麦及制品会引起中枢神经系统的中毒症状,如恶心、神智抑郁和共济失调等[3]。GB 2761—2017中规定小麦和小麦粉中ZEN的最高限量为60 μg/kg。目前,ZEN检测方法有精密仪器分析法、生物传感器法和免疫分析法。精密仪器分析法有高效液相色谱法[4]、气相色谱质谱法[5]和薄层色谱法等[6],具有分析较迅速和检测限低等特点;生物传感器法主要有电化学生物传感器法、光学生物传感器法、测温生物传感器法和压电生物传感器法等,具有选择性好等特点[7];常用的免疫分析法有酶联免疫分析法[8]和胶体金免疫分析法[9]等,具有专一性高和特异性强的优点。

随着检测需求的提升,传统方法的灵敏度和智能程度已无法满足需求,精密仪器分析法步骤复杂,无法实现现场检测[10];生物传感器法存在结合效率低和稳定性易受到干扰等问题[11];免疫分析法也存在灵敏度低和智能化差的问题[12]。因此,亟须研究ZEN高灵敏检测技术,实现ZEN的早检测和早发现。

纳米标记材料乳胶微球(latex microsphere,LMs)具有颜色丰富、大小均匀和比表面积大的特点,为偶联抗体提供了丰富的位点。基于乳胶微球抗体探针的检测技术具有良好的稳定性与较高的灵敏度[13]。铕(Eu)是一种量子产率高、带宽窄、发射寿命长、体积大的元素,因其斯托克斯位移大和低毒等特点被广泛应用于免疫分析[14]。Eu能有效避免背景荧光的干扰,用其制备的荧光氧化物乳胶微球具有颜色鲜艳、粒径均匀和单分散性好的优点,使得基于氧化铕乳胶微球抗体探针在ZEN快速智能检测中具有结果重复性高、准确和灵敏度高等优点。作者在前期自主研发ZEN高亲和力抗体的基础上,研发了荧光定量高灵敏智能即时检测(Point-of-care testing, POCT)技术。通过优化条件获得了基于乳胶微球抗体探针的POCT技术的线性范围、最低检测限(LOD)和加标回收率,评估了其重复性(批内)和再现性(批间),为真菌毒素等危害因子检测提供了通用型技术平台和粮食减损智慧监管技术方法。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

氧化铕乳胶微球:上海优你生物科技股份有限公司;卵清蛋白(OVA)、羊抗鼠免疫球蛋白(IgG):武汉博斯特生物科技有限公司;玉米赤霉烯酮(ZEN)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、T-2毒素(T-2)、呕吐毒素(DON)、伏马菌素B1(FB1)、杂色曲霉毒素(ST)、蛇形霉素(DAS)、环匹阿尼酸(CPA):Sigma-Aldrich公司。

样品垫(GFCP000800玻璃纤维、fusion3、fusion5、滤血膜)、吸水垫:上海金标生物科技有限公司;HF135硝酸纤维素(nitrocellulose membrane,NC)膜:Millipore公司;FF120 NC膜:Whatman国际有限公司;CN95 NC膜:Sartorius公司;超纯水:Milli-Q系统。

1.2 仪器与设备

超声细胞破碎仪:美国SONICS公司;恒温孵育器:杭州瑞诚仪器有限公司;自制的智能检测设备:中国农业科学院油料作物研究所;LCMS-8060 UPLC-MS/MS仪:日本Shimadzu公司;试验筛:北京盛田嘉源科技有限公司;FEI tecnai G2 F30透射电子显微镜:美国FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 智能检测设备的设计

自制的智能检测设备结构设计如图1所示,检测时,打开锂电池的开关,电量显示器亮起,风扇排风。将数据线插头与数据口连接,将lightning接口/type-c接口/micro-USB与智能手机连接,将待测试纸条插入试纸条卡槽中,通过智能手机上的软件控制LED光源(Ex=365 nm)照射到试纸条上,摄像头采集图像,再通过应用进行解析可得待测物含量。

1.外壳;2.内置摄像头;3.LED光源;4.电量显示器;5.数据口;6.智能手机;7.lightning接口;8.type-c接口;9.micro-USB接口;10.数据线插头;11.电源口;12.锂电池;13.风扇;14.试纸条卡槽

1.3.2 ZEN抗体制备和鉴定

根据本实验室前期的报道进行ZEN抗体的制备和鉴定[15]。

1.3.3 氧化铕乳胶微球-抗体探针的研制

用于偶联ZEN单克隆抗体的氧化铕乳胶微球在可见光照射下呈白色,在紫外光照射下呈明亮的橘红色,激发波长365 nm,发射波长613 nm。氧化铕乳胶微球与ZEN单克隆抗体偶联步骤:取800 μL 0.2 mol/L pH 8.0的硼酸缓冲液,加入200 μL氧化铕乳胶微球,振荡混匀,用超声细胞破碎仪超声4 s;加入一定体积的EDC溶液(20 mg/mL),涡混匀15 min;离心10 min(13 300 r/min,10 ℃),弃去上清液;将沉淀用1 mL硼酸缓冲液重悬,振荡混匀,再用超声细胞破碎仪超声4 s;加入一定量的ZEN单克隆抗体溶液,涡旋混匀,10 ℃旋转混匀12 h;离心10 min(13 300 r/min,10 ℃),弃去上清液,加入1 mL 0.5%的牛血清白蛋白(BSA)溶液重悬,涡旋混匀,10 ℃旋转混匀2 h(250 r/min);4 ℃保存待用。

在ZEN单克隆抗体标记荧光探针的制备过程中,EDC用量会影响氧化铕乳胶微球的活化程度,因此要对EDC用量进行优化。加入不同物质的量的EDC水溶液,根据试纸条检测线(T线)和质控线(C线)荧光强度选择最佳EDC用量。

1.3.4 POCT法检测条件的影响因素分析

配制1.0 mg/mL的ZEN单克隆抗体水溶液,在最佳EDC用量及氧化铕乳胶微球封闭液条件下,偶联抗体用量设置为10、20、40、80 μL,通过T/C优化出最佳抗体用量。

T线包被质量浓度优化:将不同质量浓度(0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL)的ZEN-OVA包被于NC膜T线处,取氧化铕乳胶微球偶联的单克隆抗体于微孔中,插入试纸条进行反应,检测系列ZEN标准品,根据灵敏度选择ZEN-OVA最佳包被质量浓度。

C线包被质量浓度优化:将不同质量浓度(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)的羊抗鼠IgG包被于NC膜的C线位置,取氧化铕乳胶微球偶联的单克隆抗体于微孔中,插入试纸条进行反应,根据C线荧光强度选择IgG最佳包被质量浓度。

1.3.5 POCT法原材料的优选

使用fusion3、fusion5和滤血膜3种样品垫;CN95、FF120和HF135 3种NC膜,按照上述优化条件,用ZEN系列标准品溶液(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL)点样,观察荧光氧化铕乳胶微球在NC膜上的移动速度、背景是否干净等;反应结束后,采用自制的智能检测设备读数,考察线性范围和相关系数等,优选出合适的样品垫和NC膜。

选择合适的样品垫和NC膜,在塑料衬板上由下至上依次粘贴样品垫、NC膜和吸水垫,相邻各垫在连接处交叠1 mm,检测垫以NC膜为基垫,自下而上设置横向T线和C线。使用BioDot XYZ 3050划膜仪,以0.7 μL/cm的速率划膜,划好T线和C线后,37 ℃烘箱处理1 h,取出切条(宽4 mm),4 ℃密封保存。

1.3.6 样品前处理

将小麦粉碎成粉末,过试验筛(1 mm孔径)后称取小麦粉末25 g,加入100 mL乙腈/水(体积比为60∶40)[16],高速均质3 min(15 000 r/min),过滤后取滤液1 mL加入3 mL样品稀释液,混匀待测。

1.3.7 POCT法与UPLC-MS/MS法比对验证

提前将未使用的试纸条及配套试剂从冰箱中取出平衡至室温。将一定量的BSA、吐温-20(Tween-20)、蔗糖、海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮-30(PVPK-30)等化学试剂根据不同配比溶解于PBS缓冲液中,配制成样品稀释液。将样品稀释液加入试样微孔中,加入抗体标记的氧化铕乳胶微球,混匀,用自制的智能检测设备进行测试,根据背景干扰、T线和C线的清晰程度确定最佳的样品稀释液配方。在最佳样品稀释液条件下进行检测,取混合后的待测样液与标记抗体的氧化铕乳胶微球加入微孔中,插入试纸条,于恒温孵育器中37 ℃反应10 min[17],将试纸条放入自制的智能检测设备中读取T线和C线荧光值。对于UPLC-MS/MS检测,滤液用0.22 μm有机过滤器进行过滤,然后注入UPLC-MS/MS进行检测。

1.4 方法学评价

1.4.1 校准曲线与最低检出限

在阴性小麦样品提取液中加入系列质量浓度(0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.8、2.4 ng/mL)的ZEN标准品,然后将待测液加至试纸条的样品孔中37 ℃反应10 min,用自制的智能检测设备读取T线和C线荧光值,计算T线与C线的信号强度比值,以ZEN质量浓度的常用对数为横坐标,以T线与C线的信号强度比值为纵坐标,建立校准曲线。

取21组空白小麦样品用试纸条进行检测,通过公式“LOD = 3δ/s”计算最低检出限(LOD),其中,δ为21个空白样品值的标准差,s为灵敏度,即校准曲线的斜率[18]。

1.4.2 重复性与再现性

用批内差异和批间差异评价智能POCT技术的重复性和再现性。以阴性小麦样品提取液为基质,添加ZEN标准品使其质量浓度为2.0 μg/kg。采用同一批次的ZEN试纸条重复6次检测,并用自制的智能检测设备读取结果作为批内差异数据;采用6个批次的ZEN试纸条进行检测,并用自制的智能检测设备读取结果作为批间差异数据。

1.4.3 稳定性

测试本研究的试纸条在180 d内是否有效,将试纸条密封储存在4 ℃的冰箱中,每30 d取出测试,考察其稳定性。

1.4.4 特异性

配制ZEN、AFB1、OTA、T-2、DON、FB1、ST、DAS、CPA 9种毒素的标准溶液1 ng/mL,用建立的智能POCT技术进行特异性验证。

1.4.5 与UPLC-MS/MS对比验证

用建立的智能POCT技术与UPLC-MS/MS进行比对,验证该技术的准确性,从而评估其检测实际样品的可行性。UPLC-MS/MS采用多反应监测模式(MRM),色谱分离柱为Thermo C18色谱柱(2.7 μm,10 cm),柱温40 ℃。流动相A为水,流动相B为乙腈。采用梯度洗脱程序:0～1 min,25% B;1～3 min,70% B;3～4 min,70% B;4～5 min,25% B。洗脱流速 300 μL/min,进样量1 μL,运行时间5 min。离子源为电喷雾离子源(ESI),质量分析器为三重四极杆,电离方式为电喷雾电离(ESI-)。毛细管电压3.0 V,源温度150 ℃,去溶剂化温度350 ℃。氩气用作碰撞气体(碰撞池,0.8 V),氮气用作雾化气体(50 L/h)和去溶剂化气体(650 L/h)。

1.5 数据处理与分析

使用LabSolution 5.89对UPLC-MS/MS所得数据进行处理。

2 结果与讨论

2.1 EDC、ZEN抗体、ZEN-OVA和羊抗鼠IgG的用量

图2为氧化铕乳胶微球的透射电子显微镜图,此微球尺寸均一、圆形、粒径200 nm左右。当加入EDC体积中的物质的量大于或等于氧化铕乳胶微球表面的羧基物质的量时,氧化铕乳胶微球才能得到充分活化。当加入的抗体量一定时,在一定范围内,EDC的用量越多,与抗体偶联的氧化铕乳胶微球数量越多,试纸条上T线和C线的荧光强度越强。当加入40 μL 20 mg/mL EDC水溶液时,试纸条T线和C线的荧光强度最合适(图3(a)),因此,40 μL 20 mg/mL EDC为最佳剂量,能确保氧化铕乳胶微球的充分活化。智能POCT技术的灵敏度受抗原和抗体用量的影响较大,通过T/C优化出1.0 mg/mL ZEN抗体最佳用量为20 μL(图3(b))。测试NC膜T线处包被不同质量浓度ZEN-OVA的试纸条,根据试纸条的灵敏度选择0.5 mg/mL ZEN-OVA为T线的最佳包被质量浓度(图3(c));测试NC膜的C线处包被不同质量浓度IgG的试纸条,根据试纸条上C线荧光强度选择0.2 mg/mL IgG为C线的最佳包被质量浓度(图3(d))。

图2 氧化铕乳胶微球的透射电子显微镜图

注:(a)EDC;(b)ZEN抗体;(c)ZEN-OVA;(d)羊抗鼠IgG。

2.2 试纸条原材料的选择

对样品垫种类和NC膜种类进行优化以获得更好的T线和C线荧光强度。通过荧光信号测试评估了T线和C线的性能(表1)。样品垫和NC膜对显色和线性的检测结果显示FF120 NC膜和fusion5样品垫的显色速度较快,背景清晰干净且线性良好。所以选择fusion5样品垫与FF120 NC膜,以保证T线和C线的荧光强度。

表1 试纸条原材料的选择

2.3 样品稀释液

在免疫层析中,用样品稀释液稀释样品,再与氧化铕乳胶微球混合后进行层析反应。样品稀释液的作用主要有:降低样品中有机相的浓度;提供稳定的pH值,保护抗体活性;使氧化铕乳胶微球均匀分散。因此,研究了各种样品稀释液配方对免疫层析结果的影响。结果表明:当样品稀释液组成为“1% 蔗糖+0.5% BSA+2.5% Tween-20+0.5% PVPK-30的PBS(pH 7.4)溶液”时,T线荧光强度最高、最清晰,背景值最小,层析效果最好。蔗糖可以增加亲水性及增加蛋白稳定性并维系蛋白结构;BSA可以消除非特异性吸附、降低背景信号、保护抗体活性及分散氧化铕乳胶微球颗粒;Tween-20为表面活性剂,可作为增溶剂和亲水剂,使活性蛋白的结合位点充分暴露,促进抗原抗体结合反应;PVPK-30是一种大分子聚合物,可作为增稠剂,帮助氧化铕乳胶微球均匀分散并在溶液中保持悬浮状态。

2.4 方法学评价

用智能检测设备读取系列校准液每个浓度点的T/C值。将每个浓度点的T/C作为纵坐标,ZEN质量浓度的常用对数作为横坐标,以最小二乘法绘制校准曲线(图4),得到校准曲线方程Y=-0.894 8X+0.457 2,R2=0.982 3。ZEN的LOD由公式LOD=3δ/s计算得出,ZEN在小麦基质中的LOD为0.02 ng/mL,线性范围0.2～2.4 ng/mL,显著高于酶联免疫分析法和胶体金免疫分析法等分析方法的灵敏度(表2)。

表2 本方法与其他ZEN分析方法的比较

注:ZEN质量浓度分别为0.2、 0.3、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、1.4、 1.8、 2.4 ng/mL;内插图为检测小麦基质中ZEN的试纸条照片。

采用同批次试纸条检测了6次加标的小麦样品。ZEN加样回收率为95.2%～104.2%,变异系数(CV)为5.5%,表明智能POCT技术具有良好的重复性;使用6个批次的试纸条检测了小麦加标样品,ZEN加样回收率为92.3%～107.5%,CV为3.4%,表明智能POCT技术具有出色的再现性。试纸条的稳定性试验得到加样回收率为95.2%～103.2%,表明试纸条在180 d内具有良好的稳定性。

为了证明智能POCT技术可以用于ZEN的快速检测,通过比较ZEN、AFB1、OTA、T-2、DON、FB1、ST、DAS和CPA 9种不同真菌毒素的荧光信号验证测试条的特异性(图5)。制备每种真菌毒素的质量浓度为1 ng/mL,进行特异性验证,对比发现测试条带对ZEN有很好的选择性。

图5 试纸条特异性分析

2.5 与标准方法比对验证

对空白小麦样品分别进行了高中低质量浓度的加标回收试验,通过智能POCT技术与UPLC-MS/MS进行比对,进一步验证智能POCT技术的准确性。ZEN的UPLC-MS/MS定量和定性离子对见表3。

如表4所示,智能POCT技术检测加标小麦样品中ZEN的回收率为104.9%～110.3%。相比之下,UPLC-MS/MS法检测加标小麦样品中ZEN的回收率为103.6%～105.7%,两种方法的检测结果符合率较高。两种方法的RSD均低于6%,结果表明所提出的ZEN智能POCT技术准确可靠。

表4 ZEN在小麦中的加标回收率

3 结论

研发了一种灵敏、快速、简便的测定小麦中ZEN的高灵敏智能POCT技术,准确性和可靠性高。基于抗原抗体的特异性免疫反应原理,采用高灵敏度氧化铕乳胶微球作为示踪物来标记抗体,采用智能手机进行现场检测。检测小麦基质中ZEN,其LOD为0.02 ng/mL,线性范围为0.2～2.4 ng/mL,加样回收率为104.9%～110.3%,批内重复性和批间再现性分别为95.2%～104.2%和92.3%～107.5%。该方法操作简便,所需时间短,与UPLC-MS/MS方法检测结果一致,为真菌毒素快速智能检测提供了通用型技术平台。本研究自制的智能检测设备和智能手机之间现只能使用有线传输数据,下一步研究可改进为蓝牙或Wi-Fi连接,提高智能化程度;此外,还可以建立数据储存云平台,有利于政府部门智慧监管。