鲍鱼内脏磷脂提取纯化工艺及抗氧化特性研究

杨芝芝,赵晓丹,叶 佳,许 慧,陈继承

福建农林大学 食品科学学院,福建 福州 350002

鲍鱼是世界上珍贵的腹足类动物,被世界各国广泛养殖[1]。中国是鲍鱼生产大国,其产量从2010年的5.56万t增加到2020年的30.35万t[2]。研究表明,从鲍鱼内脏中提取的磷脂富含多不饱和脂肪酸(PUFA),是重要的保健食品功能因子,具有良好的抗氧化活性[3-4]、抗肿瘤[5]、抗菌[6]、降血脂[7]、调节免疫[8]等功能。但目前对鲍鱼的加工主要以肌肉为主,绝大部分的内脏被加工为饲料或丢弃,造成极大的资源浪费,因此如何将鲍鱼加工下脚料进行高值化利用成为目前亟须解决的问题。

人体在代谢的过程中会产生超氧阴离子自由基(O2-·)、DPPH自由基和羟自由基(OH·)等,这些自由基不仅能使体内产生丙二醛等有害物质,造成机体衰老的同时还与肿瘤的发生密切相关[9]。在食品的加工过程中油脂极易发生氧化,不仅会破坏食品的外观和质地,还会产生过氧化脂质等有毒有害化学物质[10]。目前越来越多抗氧化剂被应用于食品工业,如BHA、TBHQ、BHT等人工合成抗氧化剂,虽具有良好的抗氧化活性,但使用时潜在的风险并不能完全消除,因此开发安全、高效的抗氧化剂是目前研究的热点。

卵磷脂是磷脂的主要组分,是促进身体各个细胞正常新陈代谢的重要天然活性物质,具有极高的营养价值。目前,卵磷脂主要在蛋黄、大豆和动物及植物的组织中被发现,但由于PUFA的种类和含量较少且胆固醇水平相对较高,导致脂肪酸的组成不够理想[11]。相较而言,鲍鱼内脏磷脂中有大量ω-3、ω-6和ω-9型等PUFA,是食品和医药领域重要原料[12]。卵磷脂的提取方法根据物质性质不同也各有差异,但基本遵循先提取粗油脂后再分离的方法,目前卵磷脂提取方法有超声波提取法[13-14]、溶剂法[15-16]、超临界流体萃取法[11,17]等。其中溶剂法因方法简单、易操作,而广泛应用于卵磷脂的提取,本研究在溶剂法的基础上结合单因素和正交试验优化提取工艺,研究鲍鱼内脏磷脂的体外抗氧化活性和抗油脂氧化的能力,为进一步开发利用鲍鱼内脏废弃物提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

鲍鱼、大豆油、菜籽油:福州永辉超市(大儒世家店)。丙酮、乙醇(95%)、抗坏血酸(Vc)等试剂均为分析纯;抗氧化测定试剂盒、1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·):北京索莱宝科技有限公司;叔丁基对苯二酚(TBHQ):上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SC-3612低速离心机:科大创新股份有限中佳分公司;EYELA MG-2200氮吹仪:上海赛默生物科技发展有限公司;HWS-24型电热恒温水浴锅:上海一恒科学仪器有限公司;UV-2601双光束紫外可见分光光度计:北京瑞利分析仪器公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

鲍鱼清洗干净后,剔除壳和肉部分,取出需要的内脏组织,然后捣碎、匀浆、冻干后磨粉,密封保存备用。

1.3.2 粗脂肪的提取

先采用Floch法[18]提取鲍鱼内脏中的粗脂肪,再用14%正己烷进行二次萃取,以上操作重复3次,通过旋转蒸发浓缩样液,计算最终得率。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 丙酮提取鲍鱼内脏粗磷脂的试验设计

取5 g鲍鱼内脏粗脂肪,固定丙酮提取时间40 min、提取3次,液料比设为5∶1、7∶1、9∶1、11∶1、13∶1(mL/g),测定粗磷脂得率。

取5 g鲍鱼内脏粗脂肪,固定液料比9∶1(mL/g)、丙酮提取3次,提取时间设为20、30、40、50、60 min,测定粗磷脂得率。

取5 g鲍鱼内脏粗脂肪,固定液料比9∶1(mL/g)、丙酮提取时间40 min,提取次数设为1、2、3、4、5,测定粗磷脂得率。

磷脂含量采用钼蓝比色法测定,粗磷脂得率=(丙酮不溶物质量/粗脂肪质量)×100%。

1.3.3.2 乙醇纯化鲍鱼内脏磷脂的试验设计

取3 g鲍鱼内脏粗磷脂,设置乙醇与其液料比为6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1(mL/g),乙醇体积分数80%、85%、90%、95%、100%,提取温度20、30、40、50、60 ℃,提取时间20、30、40、50、60 min,提取次数1、2、3、4、5,分别进行单因素试验,测定磷脂得率。

1.3.4 响应面试验设计

选取乙醇体积分数、提取时间、乙醇与粗磷脂的液料比作为影响因素设计响应面试验,评价指标为磷脂得率,确定最佳工艺条件。

1.3.5 还原力的测定

采用普鲁士蓝法测定还原力。

1.3.6 羟自由基清除作用

测定方法参考试剂盒说明书,清除率=((D1-D2)/D1)×100%,其中,D1为对照吸光度,D2为样品吸光度。

1.3.7 DPPH自由基清除作用

测定方法参考试剂盒说明书,DPPH自由基清除率= (D0-(D1-Ds)/D0)×100%,其中,D0为DPPH的吸光度,D1为样品与DPPH混合液的吸光度,Ds为没有DPPH样液的吸光度。

1.3.8 超氧阴离子自由基清除作用

超氧阴离子自由基清除率测定方法(磺胺比色法)参考试剂盒说明书,计算方法同羟自由基清除率。

1.3.9 鲍鱼内脏磷脂对不同油脂抗氧化能力测定

采用Schaal烘箱氧化法[19],过氧化值的测定参照GB/T 5538—2005。

1.4 数据处理与分析

试验数据均以平均值±标准差表示,使用SPSS 23.0进行方差显著性分析,使用Origin 8.0制图。

2 结果与讨论

2.1 丙酮提取鲍鱼内脏粗磷脂单因素试验

丙酮提取鲍鱼内脏粗磷脂的单因素试验结果见图1。由图1(a)和(b)可知,随着液料比和提取次数的增加,粗磷脂得率逐渐减少,即增大液料比和提取次数,可以让磷脂以外的非目标提取物溶解更彻底,但当液料比超过9∶1,提取次数超过3次后,粗磷脂得率逐渐平衡,说明丙酮提取能力已达到极限。由于丙酮自身的局限性,从减少其残留角度考虑选择液料比为9∶1 ,提取次数为3次。由图1(c)可知,粗磷脂得率随提取时间的延长而减少,在40 min时最小,然后又逐渐增加,说明提取时间过短,非目标物质未能与乙醇充分溶解;40 min后磷脂得率又开始增加,可能是反应时间过长导致磷脂氧化而使溶解物质量增加,不利于磷脂提取。因此选择丙酮提取时间为40 min。

注:(a)—(c)分别为液料比、提取次数和提取时间对粗磷脂得率的影响。不同小写字母表示差异显著(P<0.05),图2同。

经过单因素试验优化后采用液料比9∶1,提取时间40 min,提取3次为最佳条件,粗磷脂得率为(26.75±0.87)%。

2.2 乙醇纯化粗磷脂单因素试验

乙醇纯化粗磷脂的单因素试验结果如图2所示。由图2(a)可知,随着液料比增大磷脂得率明显提高,但是在液料比达到10∶1后,磷脂得率基本稳定,说明乙醇的提取能力已经达到最大,考虑生产成本等因素,选择最佳液料比为10∶1。由图2(b)可知,随着乙醇体积分数的增大,磷脂得率逐渐提高,在乙醇体积分数为90%时达到最高,继续提高乙醇体积分数,磷脂得率反而下降,可能是乙醇与磷脂反应过程中二者极性相似相溶,增加偏极性乙醇浓度,使得偏弱极性的磷脂更易与其相溶,导致磷脂提取率降低,因此选择乙醇体积分数为90%。由图2(c)可知,磷脂得率随乙醇提取时间增加而增加,原因是乙醇纯化磷脂的过程是固、液之间扩散的过程,延长提取时间有利于固、液充分混合;但在提取40 min后,磷脂得率反而下降,提取液中磷脂浓度随时间的延长而升高,导致分子间传质推动力减弱,得率下降,因此,选择提取时间为40 min。从图2(d)可知,磷脂得率在40 ℃时达到最大值,当温度高于40 ℃时磷脂得率不断下降,这是因为温度过高导致磷脂氧化分解,因此选择40 ℃为最佳提取温度。

注:(a)—(d)分别为液料比、乙醇体积分数、提取时间和提取温度对磷脂得率的影响。

2.3 乙醇纯化粗磷脂响应面试验

乙醇纯化粗磷脂响应面试验方案及结果见表1。

表1 乙醇纯化粗磷脂响应面试验方案及结果

使用Design Expert软件,将表2中的数据进行多元回归拟合,得到回归方程:Y=29.01+1.91A+1.21B-1.27AC-5.59A2-4.34B2-4.14C2。从表2可以看出,整体模型的P<0.000 1,表明该模型极显著,而失拟项P=0.597 2(P>0.05),失拟项不显著,且该模型的R2=0.98,说明该模型与实际试验拟合较好,可用于磷脂萃取试验的理论预测。

表2 方差分析

由表2可知,影响磷脂得率的主次因素为A>B>C,即乙醇体积分数>浸提时间>乙醇与粗磷脂的液料比。各因素交互作用对磷脂得率的影响为AC>AB>BC,即乙醇体积分数和乙醇与粗磷脂的液料比的交互作用达显著水平。通过软件分析处理后获得乙醇纯化磷脂的最佳工艺条件:乙醇体积分数92%,浸提时间41 min,乙醇与粗磷脂的液料比10∶1,在此条件下,预测磷脂得率为29.11%。验证在该处理条件下磷脂的得率,进行3次重复试验,磷脂的实际得率为(28.72±0.68)%,接近预测值,表明上述模型是可靠的。

为再次验证回归模型的实用性,从乙醇体积分数、浸提时间和液料比中任意选取3组参数进行试验,测定不同参数条件下的磷脂得率,分别为20.72%、27.28%、24.79%,同条件下的回归方程预测值为22.04%、24.91%、21.43%。结果显示,3组不同纯化条件下验证试验所得的磷脂得率与回归方程的预测值基本吻合,说明回归模型可应用于鲍鱼内脏磷脂纯化试验。

2.4 鲍鱼内脏磷脂的抗氧化性研究

2.4.1 还原力

还原力是一种重要的抗氧化能力评价指标,与抗氧化性成正比关系[21]。图3表明鲍鱼内脏磷脂具有一定的还原力,且随鲍鱼内脏磷脂质量浓度的增加而增大。当样品质量浓度为0.5 mg/mL时,在700 nm处的吸光度为0.516,相较于对照组Vc在700 nm处的吸光度1.723,鲍鱼内脏磷脂的还原力略弱。

图3 鲍鱼内脏磷脂的还原力

2.4.2 羟自由基清除能力

羟自由基是极强的氧化剂,过量的羟自由基可使生物体内生物大分子如核酸、蛋白、脂质等发生氧化或过氧化,造成机体衰老甚至癌变[22-23]。鲍鱼内脏磷脂对羟自由基的清除能力见图4。羟自由基清除率随着磷脂质量浓度的增加逐渐增大,由质量浓度与清除率关系式可得磷脂的IC50为1.37 mg/mL;Vc清除自由基能力与其质量浓度关系:y=0.172 6lnx+0.948,IC50为0.08 mg/mL,是磷脂的17倍。说明与Vc相比,鲍鱼内脏磷脂的羟自由基清除能力较差。

图4 鲍鱼内脏磷脂对羟自由基清除作用

2.4.3 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基的有机溶液为紫色,最大吸收峰在波长517 nm处,当与自由基清除剂作用时,溶液由紫色变为黄色,吸光度降低,因此可用其来评价抗氧化物的自由基清除能力[24-25]。如图5所示,在1～300 μg/mL范围内,鲍鱼内脏磷脂对DPPH自由基的清除作用随着磷脂质量浓度增加逐渐增大,300 μg/mL磷脂对DPPH·的清除率仅为48.63%,IC50为434.121 μg/mL;Vc清除自由基能力与其质量浓度关系:y=0.025 5lnx+0.729 2,IC50为8.99 μg/mL。说明鲍鱼内脏磷脂对DPPH自由基具有一定的清除作用,但与Vc相比相对较弱。

图5 鲍鱼内脏磷脂对DPPH自由基清除作用

2.4.4 超氧阴离子自由基清除能力

超氧阴离子自由基是机体在代谢过程中产生的活性氧自由基,会导致脂质过氧化而加速机体衰老和病变[26]。鲍鱼内脏磷脂对超氧阴离子自由基清除能力的测定结果如图6所示,在0.01～1.5 mg/mL范围内,超氧阴离子自由基清除率随着磷脂质量浓度的增加而增加,其中IC50为0.36 mg/mL;Vc与其清除率之间的关系:y=0.401 6lnx+0.911 8,IC50为0.43 mg/mL。表明鲍鱼内脏磷脂对超氧阴离子自由基有较强清除能力。

图6 鲍鱼内脏磷脂对超氧阴离子自由基清除作用

2.4.5 鲍鱼内脏磷脂对不同油脂的抗氧化能力

图7为不同添加量的鲍鱼内脏磷脂和TBHQ在大豆油和菜籽油中的抗氧化能力。与空白组相比,鲍鱼内脏磷脂对菜籽油、大豆油均有一定的抗氧化作用,且随着质量浓度的增加,抗氧化作用越明显。在两种植物油中,磷脂添加量为0.5%时,POV较小,对油脂的抗氧化能力最强,与添加量0.02%的 TBHQ相比,二者对油脂的抗氧化作用相近,均呈现出一定的抗氧化能力。因此在生产过程中添加0.5%的磷脂能够防止大豆油和菜籽油中过氧化脂质的产生,从而防止油脂发生腐败变质。

图7 鲍鱼内脏磷脂对大豆油和菜籽油的抗氧化能力

3 结论

通过试验得到了鲍鱼内脏卵磷脂的最佳提取工艺条件,在该条件下磷脂得率高达(28.72±0.68)%。体外抗氧化性结果表明鲍鱼内脏磷脂具有一定的羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基清除能力及还原力,这与鲍鱼内脏脂质中含有丰富的不饱和脂肪酸密切相关;且在大豆油、菜籽油中均有一定的抗氧化作用,即添加0.5%的磷脂就可以对菜籽油和大豆油达到较好的抗氧化作用。本研究为更安全有效地利用鲍鱼加工下脚料提供了方法,且为进一步开发利用鲍鱼内脏废弃物抗氧化性能提供科学的理论依据。但对不同品种鲍鱼间磷脂的差异、纯化对鲍鱼磷脂抗氧化性的增效机理、鲍鱼磷脂脂质体的特性都还待进一步研究。