芸薹属植物细胞质特异分子标记的开发

于海波,张东锁,高连亮,董 慧,郭 媛,胡胜武

(西北农林科技大学 农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌 712100)

十字花科芸薹属包含许多重要的油料、蔬菜和饲用植物[1]。该属植物包含6个重要的栽培种,其中3个二倍体基本种白菜(BrassicarapaL.)、甘蓝(B.oleracea)、黑芥(B.nigra),以及这3个二倍体之间相互两两杂交后染色体加倍得到的3个四倍体复合种,甘蓝型油菜(B.napus)、芥菜型油菜(B.juncea)、埃塞俄比亚芥(B.carinata),它们之间的遗传关系可以用著名的禹氏三角来表示。

植物遗传信息由细胞核和细胞质基因组(线粒体、叶绿体基因组)组成,线粒体基因与细胞核基因之间相互交流,影响植物一些重要性状的表达,例如雄性不育、抗病性、种子发育等[2-4]。目前,芸薹属禹氏三角的6个栽培种甘蓝型油菜[5]、芥菜型油菜[6]、埃塞俄比亚芥[6]、白菜[6-7]、甘蓝[6,8]、黑芥[9]的线粒体DNA已完成测序。而且,芸薹属植物中一些重要的细胞质雄性不育材料,例如polCMS[10],hauCMS[11],oguCMS[12]以及BVRC-CMS96[13]的线粒体DNA也成功测序。基于线粒体DNA基因组上的细胞质雄性不育相关基因序列或者染色体结构变异(例如InDel、SSR等),前人开发出了鉴定细胞质类型的分子标记,并对甘蓝型油菜[14-15]、白菜型油菜[16]、芥菜型油菜[17]的细胞质类型(线粒体类型)进行了鉴定。研究结果表明,甘蓝型油菜、芥菜型油菜、甘蓝细胞质存在丰富的种间[18-19],或者种内多样性[14,20-21]。梁龙兵等[19]利用线粒体及叶绿体特异SSR标记,对甘蓝型油菜等6个芸薹属栽培种进行了分析,发现5对特异性引物能较好地鉴别芸薹属栽培种。

芸薹属植物细胞质多样性的研究,对其起源进化和遗传育种具有非常重要的意义。因此,本研究利用33份芸薹属植物材料,其中20份甘蓝型油菜、2份芥菜型油菜、2份埃塞俄比亚芥、3份甘蓝、2份白菜、2份黑芥,以及1份芸芥和1份板蓝根作为对照,利用文献报道的细胞质分子标记对参试材料进行鉴定,结果发现前人报道的引物具有新的利用价值。研究结果将对芸薹属植物种质资源的保护、挖掘与育种利用具有重要的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材 料

参试材料为33份芸薹属植物材料,其中包括20份甘蓝型油菜(B.napus)、2份芥菜型油菜(B.juncea)、2份埃塞俄比亚芥(B.carinata)、3份甘蓝(B.oleracea)、2份白菜(B.rapa)、2份黑芥(B.nigra),以及1份芸芥(Erucasativa)和 1份板蓝根(Isatisindigotica)作为对照(表1)。上述材料均由西北农林科技大学油菜研究中心提供,于2020年9月下旬种植于西北农林科技大学曹新庄试验地(N 34.30°,E 108.10°),常规田间管理。

表1 供试材料信息

本研究所用引物及信息见表2,来源于前人文献报道[9,14,17,22]。上述引物均由擎科试剂公司(西安,中国)进行合成,ddH2O稀释至工作液(10 μmol/L),4 ℃保存,备用。

表2 引物信息

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取 每份材料于幼苗期(2～3叶)随机选取15株,采取整株幼嫩叶片混样0.3 g,利用改良的CTAB法[23]进行总DNA的提取。DNA沉淀用50 μL ddH2O溶解,1.5%琼脂糖凝胶电泳检验DNA质量,并用分光光度计(BioTek Instruments,美国)检测浓度,用ddH2O稀释至40 ng/μL的工作浓度。

1.2.2 PCR反应体系及产物的检测 参试材料细胞质类型鉴定的一步多重PCR方法如Zhao等[14]的报道。Indel-F/R、rsp3F/R-1和mtSSR2-F/R引物PCR反应体系均为20 μL,其中包括40 ng/μL DNA模板1.5 μL,2× Es Taq PCR Mix 10 mL(康为,北京),正向、反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL,6.9 μL ddH2O,扩增程序参照Shu等[22]的报道。

PCR反应结束后,取5 μL扩增产物进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,在120～140 V电压下电泳30～40 min,电泳结果用凝胶成像系统(勤翔,中国)观察并拍照记录。

1.2.3 DNA胶回收测序及序列比对 根据DNA胶回收试剂盒(全式金,北京)说明书步骤进行PCR扩增产物回收,由擎科试剂公司(西安)完成测序,测序结果使用DNAMAN 8.0软件比对分析。

2 结果与分析

2.1 参试材料的一步多重PCR扩增结果

利用Zhao等[14]发明的一步多重PCR方法,对参试材料进行扩增鉴定。结果(图1)表明,在20份甘蓝型油菜中,有10份材料为nap细胞质类型,6份为pol类型,4份为cam类型。2份芥菜型油菜为cam类型,2份白菜为cam类型。该方法还在参试其他材料中也扩增出特异的条带类型,在甘蓝材料中扩增出500 bp和1 000 bp左右的特异带型,将其命名为Bol-type;在2份黑芥材料中扩增出了2种不同的带型,分别命名为Bni-typeⅠ和Bni-typeⅡ,在2份埃塞俄比亚芥材料中,扩增出的带型与Bni-typeⅠ相似;在1份板蓝根中扩增的带型与Bni-typeⅠ相似,命名为Bni-typelike;在芸芥中扩增出750 bp和 1 200 bp左右的特异带型,将其命名为Esa-type(图1,表1)。

M表示Marker,nap,pol,ogu, IP-ogu和cam分别表示nap,pol,ogu,IP-ogu和cam细胞质材料,编号1～33代表的材料信息同 表1

2.2 Indel-F/R引物扩增结果

利用Indel-F/R标记[18]对参试植物材料进行PCR扩增。结果(图2)表明,在17份参试材料中扩增出3种不同大小的片段(分别是251 bp,282 bp和344 bp)。在2份芥菜型油菜材料中,一份材料(No.2)扩增出282 bp条带,而另一份材料(No.3)扩增出251 bp条带;在3份甘蓝材料中扩增出282 bp条带;在2份白菜、2份埃塞俄比亚芥、2份黑芥、1份芸芥和1份板蓝根材料中均扩增出251 bp条带。在4份甘蓝型油菜材料中,有1份pol细胞质类型材料(No.4)和1份cam细胞质类型材料(No.7)中扩增出251 bp条带,而2份nap细胞质材料(No.5,No.6)却扩增出344 bp条带(图2,表1)。

M.Marker;编号1～17.材料信息同表1

再利用该引物对16份不同细胞质类型的甘蓝型油菜,其中有8份nap材料,5份pol材料和3份cam材料(图3,表1),进行PCR扩增。结果表明,在参试8份nap材料(No.18～25)中均扩增出344 bp条带,而在3份cam材料(No.26～28)和5份pol材料(No.29～33)中均扩增出251 bp条带(图3)。

M.Marker,编号18～33.材料信息同表1

为明确Indel-F/R引物在不同细胞质甘蓝型油菜扩增产物的核苷酸序列,对上述nap、pol和cam细胞质甘蓝型油菜PCR扩增产物进行测序,测序结果用软件DNAMAN进行比对分析。结果(图4)表明,Indel-F/R引物在nap类型材料中扩增产物大小为344 bp,在pol和cam类型中扩增产物大小为251 bp。在pol和cam类型中扩增产物核苷酸相似性为100%;nap类型扩增产物与上述2种细胞质类型(pol和cam)相比,多了一个长度为93 bp的DNA序列的插入(图4)。综上,该93 bp的InDel标记可以用作鉴定甘蓝型油菜(芸薹属植物)nap细胞质的特异分子标记。

红框中核苷酸序列为nap细胞质特有

2.3 rsp3F/R-1标记扩增结果

利用rsp3F/R-1标记对参试材料进行扩增分析,结果(图5)表明,该标记在参试材料中扩增出两种不同大小的片段(222 bp和255 bp)。在2份黑芥材料中(No.14,15)中,1份材料(No.14)扩增出为255 bp的条带,而在另1份材料(No.15)中,扩增出为222 bp的条带;在2份埃塞俄比亚芥中(No.12,13)均扩增出222 bp条带;在参试甘蓝型油菜、芥菜型油菜、白菜、甘蓝、芸芥和板蓝根材料中,均扩增出255 bp的条带。结果说明,该标记可以用以区分埃塞俄比亚芥、黑芥和其他芸薹属植物。

M.Marker;编号1～17.材料信息同表1

2.4 引物mtSSR2-F/R扩增结果

利用mtSSR2-F/R对参试材料进行扩增分析,结果(图6)表明,该引物在2份埃塞俄比亚芥(No.12,13)、2份黑芥(No.14,15)中均扩增出大小为420 bp的条带,在参试甘蓝型油菜、芥菜型油菜、白菜、甘蓝、芸芥和板蓝根材料中,均扩增出471 bp的条带。结果说明,该标记也可以区分埃塞俄比亚芥、黑芥和其他芸薹属植物。

M.Marker;编号1～17.材料信息同表1

3 讨 论

十字花科芸薹属植物包含许多重要的油料、蔬菜和饲用作物,细胞质类型的分析对其起源进化和遗传育种具有非常重要的意义。本研究利用已报道的细胞质特异分子标记对33份芸薹属植物进行PCR扩增分析,研究结果表明,笔者前期开发的一步多重PCR技术[14]不仅能够在一次PCR反应中鉴定pol、ogu、IP-ogu、nap、cam等5种不同油菜细胞质类型,同时发现该方法在埃塞俄比亚芥、黑芥、甘蓝、芸芥和板蓝根中扩增出特异的条带,可以用来鉴定埃塞俄比亚芥、黑芥、甘蓝、芸芥和板蓝根等物种的细胞质类型。引物Indel-F/R在nap细胞质甘蓝型油菜材料中扩增出一个长度为344 bp的特异条带,在pol和cam细胞质材料中扩增产物长度为251 bp的条带;序列比对发现该引物在nap细胞质材料中扩增产物多一个长度为93 bp的插入片段,该InDel标记可鉴别甘蓝型油菜的nap细胞质。引物mtSSR2-F/R和rsp3F/R-1也在参试芸薹属植物扩增中表现出多态性,可用作区分埃塞俄比亚芥、黑芥细胞质类型的分子标记。研究结果对芸薹属植物种质资源的鉴定、保护及育种利用具有重要的参考价值。

Kang等[17]利用全基因组测序及重测序的方法,基于全球480份不同类型芥菜类植物(B.juncea)的细胞核及细胞器(线粒体及叶绿体)基因组的系统发育,对芥菜类植物的起源、驯化和多样性进行了探究。他们基于线粒体DNA基因组的重测序结果,开发了1对引物Indel-F/R,该引物能在参试芥菜材料中扩增出2种条带(125 bp和156 bp)。本研究中,笔者利用该Indel-F/R引物,也在参试的2种芥菜型油菜中扩增出了2种不同大小条带(251 bp和282 bp),它们之间也相差31 bp,然而其片段大小与Kang等[17]研究结果不同,其原因还需进一步探究。更为有价值的是,本试验发现该Indel-F/R引物在甘蓝型油菜nap细胞质材料中,能够特异地扩增出大小为344 bp的条带;经测序发现,与pol和cam细胞质类型材料的扩增产物比较,nap类型材料的扩增产物多了一个长度为93 bp的DNA插入片段。因此,该93 bp的InDel标记,可以用作鉴定甘蓝型油菜nap细胞质的特异分子标记。目前,对nap细胞质的鉴定主要根据napCMS特异基因orf222判断[15],本研究开发的该93 bp的InDel标记丰富了nap细胞质的鉴定方法。

前人研究结果表明,黑芥是埃塞俄比亚芥的母本亲本种[24]。Yamagishi等[9]完成了黑芥的线粒体基因组测序,通过比较黑芥和埃塞俄比亚芥[7]的线粒体基因组,发现在线粒体基因组的53个基因中,二者仅有1个基因(rps3)存在序列差异;基于该基因第二外显子上的一个InDel序列,开发了rsp3F/R-1引物。本研究利用该引物对2份黑芥材料进行分析,结果其中1份材料扩增出255 bp的条带,而另1份材料扩增出222 bp的条带,而2份埃塞俄比亚芥扩增出222 bp的条带。本研究结果与Yamagishi等[9]一致,支持黑芥是埃塞俄比亚芥的母本亲本种的观点。同时,在利用一步多重PCR鉴定参试材料细胞质类型时,发现2份黑芥的扩增结果存在差异,表明两份黑芥的线粒体基因组存在一定的多态性,可以利用亲本种黑芥来拓宽埃塞俄比亚芥的细胞质遗传多样性。

前人在菜花(B.oleraceavar.italica)细胞质类型鉴定研究中,从21对线粒体SSR(mtSSR)引物和32对叶绿体SSR(cpSSR)引物中,筛选到1对SSR引物(mtSSR2-F/R),可以将菜花雄蕊心皮化细胞质雄性不育材料和正常细胞质材料鉴别开来;序列分析发现,mtSSR2-F/R开放阅读框比正常材料缺少51 bp,该开放阅读框位于芸薹属植物线粒体基因组orf125与orf108之间,与萝卜(Raphanussativus)和埃塞俄比亚芥(B.carinata)具有高度同源性[22]。本研究中,笔者利用该对引物对参试材料进行扩增分析,结果发现,该引物在2份埃塞俄比亚芥和2份黑芥中扩增出大小为420 bp的条带,而在参试的甘蓝型油菜、芥菜型油菜、白菜、甘蓝、芸芥和板蓝根材料中,均扩增出471 bp的条带,该标记可以区分埃塞俄比亚芥、黑芥和其他芸薹属植物。本研究结果不仅支持Shu等[22]研究结果,而且丰富了前人内容。

总之,本研究以33份芸薹属植物为材料,发现前人报道的细胞质特异分子标记具有新的利用价值,研究结果对芸薹属植物的起源进化研究和遗传育种具有重要的参考价值。