山羊α-干扰素基因克隆、原核表达及其抗病毒活性研究

徐菁昱, 刘艳芬, 陈绍红,刘 铀

(1.广东海洋大学 滨海农业学院,广东湛江 524088;2.广东海洋大学 食品科技学院,广东湛江 524088)

中国是世界上养羊数量最多的国家,羊肉总产量居世界首位[1]。近年来,随着规模化养羊业的快速发展,传染病尤其是病毒性传染病成为制约中国养羊业健康发展的重要因素[2]。流行病学调查显示,严重危害山羊健康的疾病多达54种,传染病占64.8%,其中病毒性传染病占31.4%,且多种病原体混合感染的情况较为普遍[3]。因此,通过疫苗接种控制传染病暴发流行的同时,积极研究开发广谱、高效、安全的抗病毒制剂对于山羊病毒性传染病的防治有着十分现实的意义。

审美趣味的改变制约了水墨动画的进一步发展。上世纪80年代以后，西方审美标准的盛行改变了动画受众的审美趣味，继而影响了国产动画的创作风格，水墨动画随即成为过眼烟云。随着社会的发展和进步，在高科技迅速发展的时代，中国的日新月异，各种先进的动画技术以及西方审美思想的影响，从制作技术、审美趣味到艺术风格上，中国的动画片逐渐被“西化”，丧失了本民族的特色和优势，外来动画风格成为动画创作的主要风格。

干扰素(interferon,IFN)是在病毒或其他抗原刺激下由白细胞和淋巴细胞分泌的一类糖蛋白[4],具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性[5-6],其中α-干扰素的抗病毒活性最强[7]。采用体外培养外周血单核细胞、病毒或丝裂原诱导是制备天然干扰素的常规方法,但干扰素产量低,纯化不易,且生产成本较高,极大地限制了干扰素的临床应用。利用基因工程技术生产重组干扰素是解决这一难题的有效途径。目前,重组α-干扰素制剂已在医学临床中得到广泛应用,在人类病毒性疾病的预防和治疗中发挥了重要作用[8]。近年来,重组干扰素已应用于犬、猫、猪、鸡等病毒性传染病的预防和治疗[9]。目前,有关雷州山羊α-干扰素基因的遗传变异、重组山羊α-干扰素的抗病毒活性的报道较少,市场亦无商品化山羊干扰素产品。

本研究通过克隆雷州山羊α-干扰素基因,分析其遗传变异,将其成熟肽编码序列导入大肠杆菌表达,制备重组α-干扰素成熟肽并检测其抗PPRV和GPV的活性,旨在为山羊病毒性传染病的防治提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂

雷州山羊来自广东海洋大学雷州山羊保种场;质粒pET-32a(+)、大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α和BL21(DE3)、Vero细胞、LDG-2细胞、小反刍兽疫病毒疫苗株Nigeria 75/1(Peste des petits ruminants virus,PPRV)、山羊痘病毒疫苗株AV41(Goat pox virus,GPV)均由广东海洋大学生化中心保存。

雷州山羊α-干扰素基因与猪(NM_214393)、人(NM_024013)和鼠(NM_010502)的核苷酸序列同源性较低,分别为81.6%、77.8%和70.0%,氨基酸序列同源性分别为67.9%、61.6%和 55.3%(表1),说明与反刍动物亲缘关系较远的动物种属之间α-干扰素基因序列存在较大差异。

1.2 引物设计

根据GenBank中山羊IFN-α基因序列(登录号:FJ959074)设计引物,F1:5′-ATGGCCCCAGCCTGGTCCTTA-3′,R1:5′-TCAGTCCTTCCTCCTGAATCTCTCC-3′用于扩增α-干扰素全基因;F2:5′-CATGCCATGGCAGGCTGCCACCTGCCTCACATCCA-3′(NcoⅠ),R2:5′-CCCAAGCTTTCAGTCCTTCCTCCTGAAT CT-3′(HindⅢ)用于扩增α-干扰素成熟肽编码序列。引物由上海生工生物工程股份有限公司 合成。

1.3 山羊α-干扰素全基因的克隆

利用DNA凝胶回收试剂盒纯化目的基因片段后,与pMD19-T载体于16 ℃连接过夜,连接产物用于转化DH5α感受态细胞。挑取阳性克隆作增菌培养,以菌液为模板,按上述条件进行PCR扩增。阳性转化子用质粒DNA提取试剂盒提取质粒,分别用HindⅢ和HindⅢ+BamH Ⅰ 酶切消化,消化产物用10 g/L琼脂糖电泳鉴定。经PCR和酶切鉴定的重组质粒由上海生工生物工程股份有限公司测定目的基因核苷酸序列。重组质粒命名为pMD19-T-IFN-α。

在25 μL反应体系中加入RNA模板5 μL、dNTP(10 mmol/L)1 μL、Oligo dT 1 μL、5×RT Buffer 5 μL、Rnase Inhibitor 0.5 μL、M-MLV RT 1 μL、DEPC水11.5 μL,采用反转录制备α-干扰素全基因cDNA。反应条件为: 65 ℃ 5 min,42 ℃ 50 min,70 ℃ 5 min。在20 μL反应体系中加入cDNA 5 μL,F1/R1各1 μL,dNTP 0.4 μL,Taq酶0.2 μL,10×Buffer 2 μL,ddH2O 10.4 μL,采用PCR方法扩增山羊IFN-α全基因。反应条件为:94 ℃ 3 min;94 ℃ 40 s, 56 ℃ 40 s,72 ℃ 40 s,32 个循环,72 ℃ 延伸 10 min。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳 检测。

无菌采集健康雷州山羊静脉血,用外周血淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞,按2×106mL-1接入细胞培养瓶,加入终质量浓度为5 μg/mL的植物血凝素(PHA),于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后,3 500 r/min离心收集细胞,采用Trizol 试剂提取细胞总RNA,琼脂糖电泳检测RNA完整性,紫外吸收法测定RNA含量。

1.4 山羊α-干扰素表达载体的构建

采用微量细胞病变抑制法检测重组山羊α-干扰素的抗病毒活性[13]。将Vero细胞和LDG-2细胞分别接种96孔板,待细胞长至单层,试验组细胞分别加入用维持液进行4倍倍比稀释的重组山羊α-干扰素100 μL,每个稀释度8个重复,细胞对照组和病毒对照组分别加入100 μL维持液,于37 ℃、5% CO2条件下培养。24 h后,试验组和病毒对照组的Vero细胞按100 μL/孔分别加入100TCID50的PPRV悬液,试验组和病毒对照组LDG-2细胞则按100 μL/孔分别加入100TCID50的GPV悬液。每12 h观察细胞病变情况,待病毒对照组出现明显细胞病变,将试验组中抑制50%细胞病变的干扰素最高稀释度确定为1个干扰素活性单位。

1.5 重组山羊α-干扰素基因的原核表达及表达条件优化

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薛宇航：这篇作文写完后，我自己读了两遍，感觉还不错，严老师也表扬了我，说写得不错。看过两位“小编辑”的修改之后，我觉得他们改得真好，我的这篇作文，果然还有很大的提升空间。看来，以后我写完作文，也要注意多修改了。

1.6 重组山羊α-干扰素融合蛋白的分离与纯化

根据“1.5”的检测结果,用优化后的条件诱导表达目的蛋白。破碎细胞后收集沉淀,获得包涵体。用2 mol/L尿素洗涤、8 mol/L尿素溶解包涵体后,稀释变性液至尿素终浓度为4 mol/L后置于透析袋中,分别用3、2、1、0.5 mol/L尿素梯度透析复性[11-12]。复性蛋白用Ni-NAT亲和层析柱纯化,用10K超滤管浓缩目的蛋白,并以PBS缓冲液洗脱。所得蛋白质样品经Western-blot鉴定、BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度后,用 0.22 μm滤膜过滤除菌分装,-80 ℃保存,备用。

1.7 重组山羊 α-干扰素的抗病毒活性测定

以pMD19-T-IFN-α质粒为模板、F2/R2为引物扩增山羊α-干扰素成熟肽编码序列,扩增产物和pET-32a(+)分别用NcoⅠ、NcoⅠ+HindⅢ限制性内切酶消化,消化产物用10 g/L琼脂糖电泳分离,经DNA凝胶回收试剂盒纯化后的目的基因和载体用T4 DNA连接酶于16 ℃连接过夜,连接产物用于转化DH5α感受态细胞。重组质粒参照“1.3”中的方法进行PCR和酶切鉴定,重组质粒命名为pET-mIFN-α。

2 结果与分析

2.1 山羊α-干扰素全基因的克隆与序列分析

以pMD19-T-IFN-α为模板、F2/R2为引物扩增获得大小约为500 bp的特异性扩增片段。重组质粒pET-mIFN-α经NcoⅠ酶切消化得到大小约6 400 bp的DNA片段、经NcoⅠ+HindⅢ酶切消化得到大小约为5 900 bp的载体片段和500 bp的目的片段,与预期结果一致(图3)。

M.DL5000 DNA分子质量标准;1.山羊α-干扰素基因的扩增产物;2.HindⅢ 酶切产物;3.BamH I+HindⅢ酶切产物

测序结果表明,雷州山羊α-干扰素基因全长为570 bp,编码189个氨基酸。Dnastar(Version 7.1)分析结果显示,雷州山羊α-干扰素基因与GenBank 上发表的山羊(NM_001285704)、林麝(MW394237)、弯角大羚羊(XM_040238322)、黄牛(NM_001172041)、瘤牛(HM853483)和绵羊(XM_004004404)的核苷酸序列同源性较高,分别为99.8%、95.6%、96.8%、94.7%、94.7%和96.8%,其氨基酸同源性分别为100%、92.6%、94.7%、92.1%、93.2%和93.7%,提示反刍动物α-干扰素基因的核苷酸和氨基酸序列高度保守。

外周血淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司;RPMI 1640培养基购自北京索莱宝科技有限公司;DMEM细胞培养基、MEM细胞培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司;植物血凝素(PHA)购自上海源叶生物科技有限公司;Trizol RNA提取试剂购自Invitrogen公司;M-MLV反转录酶购自 Promega公司;pMD19-T、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、NcoⅠ,DNA片段凝胶回收试剂盒、质粒DNA抽提试剂盒、DNA分子质量标准均购自宝日医生物技术(北京)有限公司;TaqDNA聚合酶购自北京鼎国生物公司;PMSF购自北京兰杰柯科技有限公司;BCA蛋白测定试剂盒购自中国上海博彩生物科技有限公司;HRP标记的马抗小鼠IgG购自美国Cell Signaling Technology;Ni-NAT亲和层析树脂购自GE Healthcaer公司;10K超滤管购自Millipor公司。

表1 α-干扰素基因核苷酸与氨基酸序列同源性比较

氨基酸序列分析结果表明,雷州山羊α-干扰素信号肽潜在裂解位点位于N末端22～23个氨基酸,其成熟肽由167个氨基酸组成,其中无N-糖基化位点,有4个潜在的O-糖基化位点,分别为第48位(S)、第92位(S)、第140位(S)和第151位(T),4个半胱氨酸残基分别位于第24、52、122、162位,与其他反刍动物α-干扰素的一级结构相同(图2)。雷州山羊和其他反刍动物的α-干扰素成熟肽在26～185位氨基酸均含有保守的结构域,雷州山羊、弯角大羚羊和绵羊α-干扰素成熟肽在第48、140、151位均有潜在O-糖基化位点,瘤牛α-干扰素成熟肽在第48和140位也有潜在O-糖基化位点,瘤牛和绵羊α-干扰素成熟肽在第84位均有潜在O-糖基化位点,但均无潜在N-糖基化位点,且与猪、人和鼠的潜在O-糖基化位点截然不同;包括雷州山羊在内的反刍动物与猪、人和鼠α-干扰素成熟肽均含有4个位点相同的半胱氨酸残基。

2.2 山羊α-干扰素成熟肽扩增及表达载体的构建

通过RT-PCR方法扩增的雷州山羊α-干扰素全基因大小约570 bp,与预期结果一致。重组质粒pMD19-T-IFN-α经HindⅢ 酶切消化得到大小约3 200 bp的DNA片段,经BamH Ⅰ+HindⅢ酶切消化得到大小分别为2 700 bp的载体片段和570 bp的目的片段,与预期结果一致(图1)。

2.3 重组山羊α-干扰素的表达、纯化及鉴定

通过比较不同表达时间、诱导剂浓度、诱导表达温度对重组α-干扰素成熟肽表达量的影响,确定最佳表达条件为37 ℃、IPTG终浓度0.5 mmol/L、诱导表达6 h,此时重组蛋白表达量最高,且主要以包涵体形式存在,其分子质量约32 ku,与预期结果一致(图4)。Western-blot 检测结果显示,重组菌BL-pET-32a(+)和BL-pET-32a-mIFN-α的诱导表达产物均能与6×His抗体发生特异性结合反应,其分子质量分别为19 ku和32 ku,与预期结果相符(图5)。

用重组质粒pET-mIFN-α转化BL21(DE3)感受态细胞,获得重组菌BL-pET-mIFN-α,于 37 ℃、210 r/min培养至OD600nm约0.6～1.0,加入IPTG使其终浓度为0.5 mmol/L,继续诱导表达6 h,收集菌体用灭菌三蒸水重悬,反复冻融3 次,加入DNase Ⅰ 置于37 ℃至菌液不再粘稠, 4 ℃、12 000 r/min离心15 min,分别收集上清和沉淀,用12% SDS-PAGE 凝胶电泳检测;分别于25、30、37 ℃以IPTG终浓度为0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L分别诱导0、1、2、4、6 h,用12% SDS-PAGE 凝胶电泳分析重组蛋白的可溶性,以优化表达条件[10]。

M.蛋白质分子质量标准;1.诱导表达6 h的BL-pET-mIFN-α重组菌裂解产物;2.未诱导的BL-pET-mIFN-α重组菌裂解产物;3.BL-pET-32a(+)重组菌裂解产物;4.BL21(DE3)细菌裂解产物

M.蛋白质分子质量标准;1.BL-pET-32a(+)细菌裂解产物;2.纯化的rG-mIFN-α

2.4 重组山羊α-干扰素抗病毒活性测定

采用微量细胞病变抑制法检测重组山羊 α-干扰素的抗PPRV和GPV活性。对照组细胞大小形态正常,贴壁良好;病毒对照组细胞在PPRV或GPV感染后,逐渐出现细胞变圆、融合和坏死脱落现象;经 rG-mIFN-α处理的细胞,仅见少量细胞融合和脱落,且随着rG-mIFN-α终浓度增加,细胞病变程度越轻微。由此可见,重组山羊α-干扰素成熟肽能以剂量依赖方式显著抑制PPRV和GPV诱导的细胞病变(图6)。rG-mIFN-α抗PPRV和GPV活性分别为1.024×104U/mL和8.67×103U/mL,比活力分别为 1.6×104U/mg和1.35×104U/mg。说明重组山羊α-干扰素成熟肽具有较强的抗PPRV和抗GPV活性。

A.Vero细胞对照;B.rG-mIFN-α处理的PPRV感染Vero细胞;C.PPRV感染Vero细胞;D.LDG-2细胞对照;E.rG-mIFN-α处理的GPV感染LDG-2细胞;F.GPV感染LDG-2细胞

3 讨 论

本研究证实,雷州山羊IFN-α基因由570个核苷酸组成,编码189个氨基酸,与Genbank报道的其他山羊品种的α-干扰素核苷酸与氨基酸序列同源性高达99.8%和100%,仅存在1个核苷酸位点的同义突变;与绵羊、弯角大羚羊、林麝、瘤牛等反刍动物的 α-干扰素氨基酸序列都有较高同源性,与猪、人、小鼠的同源性较低,提示反刍动物的α-干扰素氨基酸序列高度保守,且亲缘关系较近的动物干扰素同源性也较高。

我恨恨地把窗户玻璃打破了，爬了出去。月亮很亮，我踩着自己的影子晃悠在扒锅街，我去找刘佳，扒锅街的人我最惦记的就是他了，我只亲了他一次，远远不够哩。

第三，游客对长江三峡地域文化认知过程具有选择性。出游前，游客通过信息刺激产生初始认知；出游过程中，游客在个体已有知识和体验的影响下，产生对信息的选择性“接触-注意-理解-保持”[33]86过程；出游后，游客形成的认知印象以概念网络的形式进行储存，反映了部分的目的地文化。

IFN-α的N-末端有22个氨基酸构成的信号肽,其切割位点位于第22位(L)和23位(G)之间,氨基酸序列分析结果表明,反刍动物α-干扰素信号肽的胞外区和胞内区均具有共同基序(motif),即MAPAWS和SCNAICS;除弯角大羚羊外,跨膜区则含有数量相同的疏水氨基酸—亮氨酸(L);除绵羊与瘤牛外,大多数反刍动物的α-干扰素信号肽裂解位点序列均为第22位(L)-第23位(G),提示反刍动物α-干扰素的易位、跨膜转运、信号肽切除及分泌机制基本相同。雷州山羊和其他反刍动物α-干扰素成熟肽在26～185位氨基酸均含有保守的结构域,其中山羊、弯角大羚羊和绵羊α-干扰素成熟肽在第48、140、151位氨基酸均有潜在O-糖基化位点,瘤牛和绵羊α-干扰素成熟肽的糖基化位点则位于第48、84、140氨基酸,且与猪、人和鼠的潜在O-糖基化位点截然不同,目前尚不清楚这些糖基化位点的细微差别对反刍动物α-干扰素高级结构和抗病毒活性的影响。

在这一段简短的语言描述里，作者综合运用了多种修辞方法：运用比喻的修辞，在把“广场”比作“露天公寓”的过程中，形象地再现了苏比生活的贫穷；运用拟人修辞，通过“打招呼”这一动词性的短语，把北风预示的寒冷以及这些寒冷给予像苏比一样穷人的警告，以一种幽默的方式体现在语言描写之中；运用借代，作者把像苏比一样的广场流浪汉们，形象地称之为“房客们”。从而在幽默之中表达着一丝讽刺。

原核表达系统具有操作简便、重组蛋白表达量高、生产成本低廉等优势。郝飞等[14]成功克隆山羊IFN-τ基因并进行原核表达,发现重组山羊IFN-τ能有效抑制水泡性口炎病毒及山羊副流感病毒3型在宿主细胞中的增殖。Jacobe等[15]在大肠杆菌中表达了绵羊IFN-γ基因,并测得融合蛋效价为3.2×105U/mg。本研究结果表明,山羊α-干扰素能在大肠杆菌中高效表达,表达量可达1.84×103mg/L,但重组山羊α-干扰素多以包涵体形式存在。通过优化表达条件如调整重组菌密度、培养温度、诱导剂终浓度等仍未能实现重组山羊α-干扰素的可溶性表达。采用常规方法对包涵体进行变性和复性处理,并通过超滤工艺大大缩短了重组蛋白的浓缩时间,获得的高纯度重组山羊α-干扰素具有较强的抗病毒活性,其抗PPRV和GPV效价分别达到1.6×104U/mg和1.35×104U/mg。值得指出的是,在原核细胞中表达的外源蛋白无法进行糖基化修饰,可能对重组蛋白的折叠、抗原表位形成、电荷性质、热稳定性及其生物学功能产生显著影响[16]。李丹等[17]利用家蚕杆状病毒表达系统表达出羊α干扰素,抗PPRV活性为6.5×105U/mL;于力等[18]利用毕赤酵母系统表达山羊α干扰素,抗病毒活性为5.62×109U/mg。考虑到真核表达系统制备重组蛋白的周期长、成本高、表达量较低等因素,原核表达系统仍是生产重组蛋白的重要手段。未来将通过选择适宜的分泌型表达载体和分子伴侣以增加重组蛋白的可溶性表达,简化重组蛋 白的分离纯化,进一步提高重组蛋白的生物学活性。