光柄菇科真菌的中国新记录种和偶见种

田慧敏,王秀艳

(赤峰学院 化学与生命科学学院,内蒙古赤峰 024000)

光柄菇科Pluteaceae隶属于担子菌门Basidiomycota、伞菌目Agaricales,1972年由Kotlába建立[1]。该科主要鉴别特征为菌褶离生,肉粉色或粉褐色;子实层菌髓为逆两侧型;孢子无色,光滑,非拟淀粉反应,成堆时粉红色,肉桂粉色;菌柄与菌盖容易分离,有菌托或菌环,或两者均无[2]。根据《菌物词典》第10版分类系统,光柄菇科包括光柄菇属PluteusFr.、小包脚菇属VovariellaSpeg.和矮菇属Chamaeota(W.G.Smith)Earle 3个属,其中前两个属是光柄菇属的主要类群,大约有350多种[3]。2011年Justo等[4]基于光柄菇科形态学分类和分子系统发育提出将小包脚菇属Volvariella中菌盖皮层呈凝胶状、平均担孢子长度≥11 μm 的种类归为 一个新属托光柄菇属VolvopluteusVizzini,隶属于光柄菇科,目前根据真菌索引统计,托光柄菇属包括9个种和变种。光柄菇科包括4个属,该科的种很多为世界分布种,多生于腐木或林地腐殖质上,早春至晚秋季节大量发生,该科许多种都是食用菌,如较常见的灰光柄菇(P.cervinus)、网顶光柄菇(P.umbrosus)、狮黄光柄菇(P.leoninus)和草菇(Volvariellavolvacea)等都是营养丰富,肉厚鲜美的食用菌[5],而有的种亦具有药用价值,如鼠灰光柄菇具有抗糖尿病和抗氧化作用。近期研究发现P.cubensis具有降解除草剂的作用[6-7]。但是个别种具毒性,如柳生光柄菇(P.salicinus)和皱皮光柄菇(P.phlebophorus)分别具神经性和损坏消化系统的毒性[8-9]。然而光柄菇科种间形态特征非常相似,差别不明显,且在不同环境条件中同种子实体大小、颜色、附属物等都有差异,包脚菇属Vovariella和托光柄菇属Volvopluteus两属有的种与鹅膏属Amanita很相似,形态学鉴定有时会发生误判的现象,基于rDNA-ITS区域的PCR扩增测序技术如ITS、nLSU和SSU应用于光柄菇科真菌鉴定和亲缘关系分析研究提升了该科真菌鉴定效率和准确度[10-12]。目前,中国已报道的光柄菇属真菌50种,小包脚菇属真菌16种[13],加之饶固等[14]报道的托光柄菇属——新记录种,共67种,远远小于实际分布,而国内关于光柄菇科的分类鉴定相关报道较少,笔者采用形态学和ITS序列测序鉴定相结合的方法对3个光柄菇科标本进行分类鉴定,以期明确其分类地位,对光柄菇科真菌资源分布与生物多样性保护及利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

标本CFSZ10115、CFSZ10295于2013-08-12,CFSZ11537于2016-08-11采自内蒙古自治区赤峰市巴林右旗赛罕乌拉国家级自然保护区,地理坐标:东经118°18′～118°55′,北纬43°59′～44°27′。拍摄生境照片后,晾干、编号,带回实验室超低温冷冻处理,室温保存于赤峰学院化学与生命科学学院菌物标本室。

1.2 形态鉴定

形态学特征鉴定方法主要参考文献[15],野外采集后用游标卡尺测量新鲜子实体的菌盖直径、菌柄直径和长度;观察和记录菌盖、菌柄和菌褶的形状、颜色及其表面是否具附属物等,观察和记录菌褶着生方式、是否有短菌褶、受伤后子实体颜色是否变化,描述菌肉颜色、味道和气味等。子实体个数以2～5为准。取干燥子实体菌盖和菌柄表皮、菌褶制成临时装片观察菌盖和菌柄皮层(皮层菌丝、囊状体)和子实层显微结构(担子、担孢子、褶侧囊体、褶缘囊体),用双目生物显微镜(奥特B203LED,爱迪泰克科技有限公司)在40倍镜下观察担孢子、囊状体、担子,菌盖和菌柄表皮囊状体、菌丝等各微观结构的颜色变化,担孢子随机测量30个,大小用长宽范围表示,小梗不计入测量值内,并计算孢子平均长度(avl)、平均宽度(avw)和长宽比(Q值),Q1=长宽比最小值-长宽比最大值,Q2=Q±SD(标准差),菌丝、囊状体、担子等测量15～20个长和宽,以长范围×宽范围表示,其中菌丝则只测量宽度,宽度以最宽处为准。再将梅尔泽试剂(Melzer’s reagent,2.5%碘化钾、1.25%碘和50%为氯醛)加入到浮载剂中显色,用双目生物显微镜观察孢子颜色有无变化,变蓝说明含有淀粉质。

1.3 系统发育树构建

取子实体干品一小部分菌盖(含菌褶)用研钵研磨后,称取30 mg粉末,用DNA提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司)提取基因组DNA。每份标本取不同的子实体提取2份DNA。PCR扩增反应正向引物和反向引物为ITS1/ITS4引物[16]。PCR扩增产物经Takara胶纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)纯化回收后委托上海生工生物科技有限公司完成测序,所测序列均保存至GenBank数据库(MG367239、MG367240和MG367242)中。将已测得的ITS序列提交GenBank检索相似序列,用MEGA7.0.26软件中的Alignment程序对检索的相似序列和标本序列进行多重对位排比,并用Analysis程序用Kimura 2-parameter模式计算遗传距离,Bootstrap循环 1 000次,采用最大似然法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 形态结构特征

2.1.1 羽状光柄菇PluteusdianaePilát 子实体小。菌盖直径3～4.5 cm,扁半球形,中央稍凸起,灰色、灰粉色、灰白色或浅褐色,干后白色,表面具平伏的浅色纤毛(图1-A);菌肉白色,极薄;菌褶粉红色,离生,稍密,不等长。菌柄3～6 cm×0.2～0.7 cm,长圆柱形,渐变中空,基部稍膨大,灰白色,基部灰褐色,有纵条纹。

A.子实体;B.担孢子; C.褶侧囊体;D.担子;E.褶缘囊体;F.菌盖菌丝;G.柄囊体;标尺(B～G)=20 μm

孢子7.2～8.8(～9.6)μm×4.8～7.4 μm,avl×avw=8.6 μm×6.6 μm,Q1=(1.0～)1.21～1.36(～1.42),Q2=1.24±0.16,近球形或宽椭圆形,无色,光滑,非淀粉质(图1-B);担子19.2～33.6(～38.2)μm×7～9 μm,近长椭圆形或短棒状,无色,光滑,薄壁,基部未见到锁状联合(图1-D);褶侧囊体43.2～74.5 μm×15～24 μm,丰富,近似棒状或梭形直至瓶状,无色透明,在Melzer氏试剂中呈现金黄色(图1-C);褶缘囊状体35～45(～60)μm×10～19 μm,丛生,近棒状或囊泡状,壁薄,光滑,无色近透明,无内含物(图1-E);菌盖表皮皮层菌丝形状不规则、不匀称,直径5.52～10.7 μm,位于菌丝的末端细胞的形状变化较大,圆筒形、棒状或纺锤形,60～178 μm×10～22.8 μm,未见锁状联合(图1-F)。菌柄表皮层菌丝平行排列整齐,无色近透明,柄囊体圆柱形或棒状,35～73 μm× 10～18 μm(图 1-G)。

研究标本:中国内蒙古赤峰市巴林右旗,赛罕乌拉自然保护区,阔叶林倒木上单生,2013年8月12日,标本号为CFSZ10115。

2.1.2 北方光柄菇PluteusleucoborealisJusto 子实体小,菌盖直径2.8～3.2 cm,半球形,白色表面有褐色鳞片,中部具明显纤毛,表皮开裂翘起成纤毛状鳞片,近皱(图2-A)。菌褶白色,离生,边缘钝圆,宽约5～7 mm。菌肉白色,薄,伤不变色,气味和味道未记录。菌褶离生,初白色,渐粉色,腹鼓状,不等长,宽0.4～0.7 cm,边缘平滑。菌柄圆柱状,3.3 cm×0.4～0.6 cm,白色或灰白色,表面有纵条纹,具褐色鳞片(图2-B)。

担孢子6.72～8.4 μm×4.8～6 μm, avl×avw=7.6 μm×5.5 μm, Q1= 1.14～1.36,Q2=1.19±0.16,光滑,近球形,卵圆形或宽椭圆形,无色,非淀粉质(图2-D)。担子22～34 μm× 7.5～11 μm,棒状或宽椭圆形,具4个孢子,壁薄,光滑,无色透明或具褐色染粒(图2-C)。褶侧囊体50～86.6 μm×16～22.8 μm,棒状或瓶形,顶端着生2～4个角,无色光滑,厚壁,少数顶端钝圆后的(图2-E),担子和褶侧囊体在Melzer氏试剂中均呈现金黄色(图2-F)。褶缘囊状体丰富,42～68 μm × 12～18 μm,棒状至狭长棒状,稀狭长囊泡状,壁薄,无色近透明。菌盖皮层菌丝呈束状排列,近圆筒状,薄壁,顶端钝圆或尖细,具隔膜,顶端细胞30～60 μm×6～10 μm,锁状联合未见(图2-G),菌柄表皮菌丝束状,近圆筒状,粗 4～20 μm,末端钝或稍尖,壁薄,无色或具褐色染色质。

研究标本:中国内蒙古赤峰市巴林右旗,赛罕乌拉自然保护区,桦树倒木上单生,2013 年 8月 13 日,标本号为CFSZ10295。

2.1.3 密执安托光柄菇Volvopluteusmichiganensis(A.H.Sm.)Justo &Minnis 菌盖直径4.2～6.3 cm,幼时呈斗笠状,成熟后逐渐平展,中央钝凸,白色或灰白色,表面覆盖中央发出的放射状褐色纤毛,中央色深呈黑褐色,向边缘渐浅,盖缘不平滑,有不同程度的裂纹(图3-A);菌肉薄,白色,无特殊气味;菌褶初白色后呈肉粉色或灰粉色,密,离生,不等长,有从盖缘发出的短菌褶(图3-B);菌柄长 5～9 cm× 0.5～1.2 cm,白色至米白色或浅灰黄色,纤维脆骨质,中空至实心,向下渐粗,柄上有白色绒毛,基部更密。菌托白色,苞片状,宽1～2 cm(图3-B)。

担孢子10～13.2(～14.4.0)μm × 6.2～7.4(～8.4)μm,avl×avw=12.6 μm×7.4 μm,Q1=1.42～1.89,Q2=1.64±0.14,椭圆形至长椭圆形,浅褐色,有的中央具一大油滴(图3-C);担子 30～52 μm×12～15 μm,棒状或倒梨形,具4小梗,较细,无色透明,有内含物(图3-E)。褶侧囊体48～102 μm×16～25 μm,纺锤形或烧瓶形,透明,薄壁(图3-D);褶缘囊体42～62 μm× 18～25 μm,纺锤形、棒状或者狭椭圆形,透明, 薄壁(图3-F)。菌盖表皮层由无色菌丝和胶状菌丝组成,无色菌丝直径3～10 μm,菌丝圆柱形,无色,壁薄,有隔膜;胶状菌丝直径6～13 μm,分枝(图3-G)。菌柄表皮菌丝排列整齐,圆柱形,无色或带有褐色素,细胞壁薄而光滑。柄囊体22～100 μm×11～18 μm, 圆柱形或纺锤形;菌托主要由致密的不规则圆柱形菌丝组成,3～18 μm(图3-H)。在所有结构中未见锁状联合。研究标本:中国内蒙古赤峰市巴林右旗,赛罕乌拉自然保护区,阔叶林地上单生,2016年 8月 11日,标本号为CFSZ11537。

2.2 rDNA-ITS测序鉴定

2.2.1 供试样品测序比对结果 对3份标本所测得的ITS序列,通过NCBI的GenBank数据库使用BLAST检索获得36个序列与供试样品具有较高相似度,物种名称、登录号和来源如表1。

表1 与供试光柄菇科3个样品ITS序列相似的序列

2.2.2 系统发育树 对所测样品的ITS序列及其相似序列构建系统发育树,结果表明:ITS序列聚为三大分支,分别为光柄菇属Pluteus光柄菇组sectionPluteus、托光柄菇属(Volvopluteus)和光柄菇属Pluteus硬毛皮层组 sectionHispidoderma;一侧支主要为光柄菇组sectionPluteus的种,包括羽状光柄菇P.dianae、粉褶光柄菇P.plautus、粒盖光柄菇P.granulatus、褪色光柄菇P.decoloratus、绒盖光柄菇P.velutinus;羽状光柄菇P.dianae位于第一侧支,与粉褶光柄菇P.plautus聚在一起;第二侧支托光柄菇属(Volvopluteus)包括密执安托光柄菇V.michiganensis、黏托光柄菇V.gloiocephalus、东方托光柄菇V.earlei、梅德尔托光柄菇V.media和库克托光柄菇V.cooke,密执安托光柄菇V.michiganensis位于第二侧支;第三侧支为光柄菇属Pluteus硬毛皮层组sectionHispidoderma的种,包括北方光柄菇P.leucoborealis、白光柄菇P.pellitus、帽状光柄菇P.petasatus;灰光柄菇P.cervinus;北方光柄菇P.leucoborealis位于第三侧支(图4)。

图4 采用最大似然法构建的系统发育树

3 结论与讨论

中国已报道的托光柄菇属(Volvopluteus)仅有两个种,即密执安托光柄菇V.michiganensis与黏盖托光柄菇V.gloiocephalus,黏盖托光柄菇V.gloiocephalus最初在小包脚菇属(Volvariella)[25],Justo等[4]通过多基因(nSSU+ITS+nLSU)构建系统发育树,将Volvariellagloiocephalus转为Volvopluteusgloiocephalu,该种在中国分布较广。本研究标本(CFSZ11537和CFSZ 11660)与之明显不同,根据Justo等[4]描述密执安托光柄菇V.michiganensis区别于其他种的特征为担孢子平均长度小于12.5 μm,菌盖边缘有裂纹;饶固等[14]描述的本种菇菌盖边缘也存在裂纹或者条纹,本研究标本菌盖边缘也具裂纹,但是裂纹较浅,可能与生境和生长周期有关,担孢子平均长稍大(12.58 μm),与测量误差存在一定的关系。分子数据显示本研究标本与密执安托光柄菇V.michiganensis相似度均在99%以上,与其他种的相似度都在94%以下。在中国主要分布于吉林省延边市,采集时间在2019年7月,2020年12月提交ITS序列,在Genbank登记(MW242665)[14],本研究标本采集时间和Genbank登记时间都先于饶固等[14]报道的新记 录种。

羽状光柄菇PluteusdianaePilát最早在捷克被采集到,随后是丹麦、俄罗斯和土耳其等少数区域有报道[19],中国未有该种报道,为中国新记录种。北方光柄菇P.leucoborealisJusto最早报道于俄罗斯西伯利亚地区,在中国分布很少,仅见于西藏昌都市[13],密执安托光柄菇V.michiganensis仅在吉林省有研究报道,二者均为内蒙古新记录种,由于其出现频率较低,认为二者均为偶见种。本研究结果扩大了它们在中国的地理分布范围,为今后科研工作者分类鉴定该科物种提供依据,对光柄菇科真菌的分布及资源现状做了有益补充,也为菌物资源生物多样性研究和食用菌开发提供了依据。