壮药四方木皮化学成分及抗炎镇痛作用研究

2023-07-19陈柳燕何翠萍蓝婷婷杨楚楚谭小姚宋亚军李永华

现代中药研究与实践 2023年3期

陈柳燕，何翠萍，李斌，蓝婷婷，杨楚楚，谭小姚，宋亚军，李永华,2*，汝梅,2*

（1.广西中医药大学药学院，广西南宁530200；2.广西高校中药民族药资源保护与利用重点实验室，广西南宁530200）

四方木皮为豆科无忧花属常绿乔木中国无忧花Saraca divesPierre 的干燥树皮[1]，属民族药中的壮药品种之一。《全国中草药汇编》中记载[2]：“四方木皮药性平，味苦涩，其既可水煎煮或浸酒服用，也可将其研磨成粉末，调酒炒热外敷，可有效治疗关节痛和风湿骨痛、跌打肿痛等；新鲜叶子捣碎后外敷，可减轻伤口肿胀和疼痛”。可见四方木皮的药用疗效较为显著，但目前国内有关中国无忧花的报道中，大多是关于其苗木的育苗栽培技术、栽培管理和引种试验等方面[3-6]，鲜有其化学成分及药理药效的相关研究报道，以至于不能很好的将其进行开发利用和推广。

印度无忧花Saraca asoca（Roxb.) Willd.在印度被称之为“万能药”，其树皮、花朵、叶子、种子都有很高的医疗价值[7-8]，且含有多种次生代谢产物，包括：生物碱类、萜类、黄酮类、酚酸类、鞣质及皂苷类等成分[9-11]。印度无忧花和中国无忧花属同属植物，亲缘关系极近，根据植物亲缘学理论，亲缘关系越接近，其化学成分越相似，药理作用也就越相近，因此，探讨四方木皮的化学成分及其抗炎、镇痛作用具有积极意义。本研究采用超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS/MS）定性表征四方木皮的化学成分，并建立两种炎症动物模型和疼痛动物模型，探究四方木皮乙醇提取物的抗炎镇痛作用，为进一步研究其药理作用和临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 药材与试剂

四方木皮购于广西玉林药市偏冷奇中草药材店，经广西中医药大学李永华研究员鉴定为豆科无忧花属中国无忧花Saraca divesPierre 的树皮。阿司匹林泡腾片（规格：0.5 g/片，批号：1912134，阿斯利康制药有限公司）；冰乙酸（批号：201807170L，成都市科隆化学品有限公司）；二甲苯（批号：20200528，天津市富宇精细化工有限公司）；角叉菜胶（批号：RQ0990，上海瑞永生物科技有限公司）；0.9%氯化钠注射液（批号：2019080116，回音必集团江西东北制药有限公司）；无水乙醇（批号：2020090102，成都市科隆化学品有限公司）。

1.2 仪器

TC10KB 型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；SB-5200D 型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；ELGA 型纯水仪（南宁市荣元生物科技有限公司）；RB-200 型智能热板仪（成都泰盟科技有限公司）；SHIMADZU Nexera X2 型超高效液相色谱（苏州雨泽仪器有限公司）；Applied Biosystems 4500 QTRAP 型串联质谱（四川仁康科技有限公司）；Scientz-100F 型冷冻机（宁波新芝冻干设备有限公司）；MM 400型研磨仪（上海土森视觉科技有限公司）。

1.3 动物

清洁级昆明系小鼠（KM 小鼠），由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK（湘）2019-0004，雌雄各半，体质量18 ～ 22 g。在屏障环境的动物室内饲养，并按照清洁级动物管理标准进行管理，小鼠健康，无伤无畸形。实验前正常适应性喂养3 d，自由饮水、摄食。

2 方法

2.1 四方木皮化学成分分析

2.1.1 四方木皮70%甲醇提取液制备将四方木皮置于冷冻机中冷冻干燥，利用研磨仪将冻干后的样品研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末状；称取100 mg 粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中；每30 min 涡旋一次，每次持续30 s，共涡旋6 次，样本置于4 ℃冰箱过夜；12 000 r/min 离心10 min 后，吸取上清，用0.22 μm 微孔滤膜过滤样品，并保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS 分析。

2.1.2 色谱条件色谱柱：Agilent SB-C18超高效液相柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相：A 相为0.1%甲酸-水，B 相为0.1%甲酸-乙腈；梯度洗脱：0 min，5%B；0 ～ 9 min，5%→95%B；9 ～ 10 min，95%B；10 ～ 11.1 min，95%→5%B；11.1 ～ 14 min，5%B；流速：0.35 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：4 μL。

2.1.3 质谱条件涡轮喷雾离子源，源温度为550℃；离子喷雾电压（IS）为5500 V（正离子模式）/-4500 V（负离子模式）；离子源气体I（GSI）、气体II（GSII）和帘气（CUR）分别设置为50、60和25.0 psi；碰撞诱导电离参数设置为高。在QQQ 和LIT 模式下分别用10 和100μmol/ L 聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ 扫描使用MRM 模式，并将碰撞气体（氮气）设置为中等。

2.2 四方木皮化学成分与抗炎镇痛作用的相关性

将“2.1”项鉴定得到的化学成分通过检索TCMSP，在“Chemical name”词条框中输入“四方木皮的次生代谢物的名称”，点击“search”，获取该成分的分子信息，包括分子名、相对分子质量（MW）、油水分配系数（AlgP）、类药性（DL）、口服生物利用度（OB，%）。本研究对各化学成分进行筛选，以数据库中可寻找到的化合物作为该药的中药化学成分获取条件；以化合物的OB≥30%、DL≥0.18 作为筛选潜在的活性成分条件，对四方木皮化学成分进行筛选。并将各个成分相关的靶蛋白和疾病下载，在Excel 表中筛选出与疾病“癌症/肿瘤”“糖尿病”“高血压”“动脉粥样硬化”“血栓性疾病”“炎性反应”和“疼痛”相关的抗病药物成分。最后鉴定出试样中相关的活性药物成分[12]。

2.3 四方木皮抗炎镇痛实验

2.3.1 四方木皮乙醇提取物的制备取干燥四方木皮100 g 打粉，置于烧杯中，加入6 倍量的50%乙醇，拌匀，浸泡1 h，超声波处理1 h，在电炉上煎煮1 h，稍稍冷却后，用12 层纱布过滤，收集滤液，用同样的方法再次提取药粉，将两次滤液合并，放在水浴中蒸干，加入蒸馏水溶解并完全转移至50 mL 容量瓶中，并将体积固定至50 mL 得到高剂量溶液（相当于2 g/mL 的生药剂量），同理，稀释该溶液至含1 g/mL 和0.5 g/mL 的生药剂量为中、低剂量溶液。

2.3.2 提取物的质控检测用同样的制备方法对三批四方木皮总酚酸的含量进行测定，测定总酚酸的含量分别为3.57%、3.49%、3.37%，平均含量为3.47%，标准差为1.0%，表明提取物的制备方法较为稳定。

2.3.3 抗炎作用实验（1）二甲苯致小鼠耳肿胀法参考GAN D L 等[13]的方法，将小鼠（雌雄均分）随机分为5 组，每组8 只，空白组（生理盐水）、阳性对照组（阿司匹林给药剂量0.4 g/kg）、四方木皮乙醇提取物低剂量组（给药剂量5.14 g/kg）、中剂量组（给药剂量10.27 g/kg）、高剂量组（给药剂量20.54 g/kg）。每天灌胃1 次，共7 d。最后一次给药后30 min，将20 μL 二甲苯均匀地涂抹到每只小鼠右耳的前部和后部以引起炎症[15]，左耳作为空白对照。炎症后30 min，以脊椎脱臼法处死小鼠，沿耳廓基线完整剪下小鼠左右耳，将左右两边耳朵相对称放置，在其重叠的相同部位用6 mm打孔器打下圆耳片，迅速用分析天平精密称重，同一只小鼠左耳对照和致炎后右耳的质量之差作为检测指标，肿胀度及其肿胀抑制率按下列公式计算。

（2）1%角叉菜胶致小鼠足趾肿胀法参考魏江存等[14]的方法，将50 只小鼠（雌雄均分）随机分为5 组，每组10 只，具体分组及给药剂量同“2.3.3（1）”。实验前，用千分尺测量小鼠右后足的厚度，末次灌胃1 h 后，将1%角叉菜胶40 μL/只皮下注射到小鼠右后足跖中部，引起炎症，炎症后每间隔1 h 立即测量小鼠右后足厚度，共计4 h，测量后，将炎症后的足厚度减去炎症前的足厚度作为检测指标，足趾肿胀度及其足趾肿胀抑制率按下列公式计算。

2.3.4 镇痛作用实验（1）热板致痛法参考谢冬养等[15]的方法，选用雌性KM 小鼠，实验前测量小鼠痛阈时间预先筛选合格小鼠。打开智能热板仪并调节温度，以保持温度恒定在（55±0.5）℃，记录将小鼠放于热板仪上至其出现舔后足所需的时间，共两次，每次间隔5 min，求出平均值作为该小鼠给药前的痛阈时间。若小鼠持续跳跃、痛反应时间少于5 s 或大于30 s，表示该小鼠疼痛反应过敏或迟钝，则排除不用。将筛选合格的小鼠随机分为5 组，每组10 只，共50 只，具体分组及给药剂量同“2.3.3（1）”项。末次给药后30、60、90、120 min，每只小鼠测定痛阈值1 次并记录，对给药后60 s 仍然没有出现疼痛表现的小鼠，立即取出并不再刺激，痛阈值按60 s 计。

（2）醋酸扭体法参考李聪聪等[16]的方法，将小鼠（雌雄均分）随机分为5 组，每组10 只，共50 只，具体分组及给药剂量同“2.3.3（1）”项。末次给药后1 h，每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液（0.01 mL/g），观察15 min 内小鼠的扭体反应次数（主要表现为腹部收缩成“S”形，腹前壁紧贴笼底，躯干与后腿伸张，臀部高起）并记录，镇痛率按下列公式计算。

2.4 统计学方法

用SPSS 22.0 软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 四方木皮化学成分分析

3.1.1 四方木皮的次生代谢总分析采用UPLCMS/MS 技术对四方木皮醇提液进行检测分析，正、负离子模式下的总离子流图（TIC 图）见图1。根据化合物质谱裂解规律，结合数据库共鉴定出541 个代谢化合物，其中包括275 个黄酮类、112 个酚酸类、39 个生物碱类、37 个木脂素和香豆素类、24 个鞣质、18 个萜类以及36 个其他类。

图1 四方木皮的UPLC-MS/MS 总离子流图Fig.1 Total Ion current diagram of UPLC-MS/MS of Saracae Cortex

3.1.2 四方木皮化学成分鉴定由于对四方木皮的次生代谢物的作用尚不清楚，因此在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）中进一步查询，鉴定四方木皮的中药化学成分及关键活性成分。结果表明，541 种次生代谢产物中有120 种是中药化学成分（包括43 种黄酮类、34 种酚酸类、12 种生物碱类、11 种木脂素和香豆素类、6 种鞣质、8 种萜类、7 种其他），黄酮类占比最大，酚酸类次之，说明四方木皮的主要的次生代谢物成分为黄酮和酚酸类。其中99 种成分对应340 种靶蛋白及324 种疾病。在541 种次生代谢产物中，筛选出27 种关键活性成分，对应219 种靶蛋白及268 种疾病，见表1。其中代谢物N-阿魏酰酪胺没有对应的靶蛋白和疾病，桑黄酮D 没有对应的疾病。在这些关键活性成分中，黄酮类代谢物占比例为70%，进一步阐释了四方木皮的主要成分为黄酮类，因此，可对这些物质进行深入研究，探索其药用价值，以用新药研发。

表1 27 种关键活性成分Tab.1 27 key active ingredients

3.1.3 主要疾病及抗炎镇痛的物质鉴定分析发现，四方木皮共有54 种代谢物（包括20 种黄酮类、19 种酚酸类、5 种生物碱类、5 种木脂素和香豆素类、1 种鞣质、1 种萜类、3 种其他类）。以上每种次生代谢物均对应2 种以上疾病，其中，有8 个代谢物均对应5 大疾病，包括白杨素、刺槐亭、桔皮素、桑黄酮S、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、5-羟甲基糠醛以及肉桂酸。还有多种代谢物对应3 ～ 4 种疾病，见表2。其中数量较多的均是黄酮与酚酸类代谢物，表明这两类物质在四方木皮的中药活性及对抗主要疾病能力中起重要作用。本研究检测到的541 种次生代谢物中，52种物质与抗炎镇痛作用有显著相关，包括20 种黄酮类、17 种酚酸类、5 种生物碱类、5 种木脂素和香豆素类、1 种鞣质、1 种萜类以及3 种其他类，见表2。结合表1 可知，四方木皮27 种潜在的活性成分中，有4 种成分发挥抗炎作用（黄芩素、金鱼草素、桑色素、二氢山柰素），有3 种发挥镇痛作用（黄芩素、异鼠李素、桑色素），而黄芩苷对这两种病症均有抗性。表明四方木皮发挥抗炎镇痛作用可能与这些成分有关。

表2 54 种抗5 大疾病及抗炎镇痛代谢物Tab.2 54 anti five major diseases, anti-inflammatory and analgesic metabolites

3.2 抗炎作用

3.2.1 四方木皮乙醇提取物对二甲苯诱导小鼠耳肿胀的影响阳性对照组和四方木皮乙醇提取物低、中、高剂量组的肿胀抑制率分别为55.1%、40.2%、49.5%、60.0%，以上药物组均可明显抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀，且四方木皮乙醇提取物三个剂量药物组与空白组相比肿胀度明显降低（P＜ 0.01），见表3。表明四方木皮乙醇提取物对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀具有明显的抗炎作用。

表3 四方木皮乙醇提取物对二甲苯诱导小鼠耳肿胀的影响（±s，n = 8）Tab.3 Effect of ethanol extract of Saracae Cortex on xylene induced ear swelling in mice （±s，n = 8）

注：与空白组比较，**P < 0.01。

组别剂量/（g/kg）肿胀度/%肿胀抑制率/%空白组—58.60±17.90—阳性对照组 0.4026.60±9.05** 55.10±12.90**四方木皮乙醇提取物低剂量组 5.1437.50±16.00** 40.20±20.60**四方木皮乙醇提取物中剂量组10.2731.40±10.5** 49.50±15.40**四方木皮乙醇提取物高剂量组20.5423.00±9.75** 60.00±17.10**F 9.08022.126 P 0.000 0.000

3.2.2 四方木皮乙醇提取物对1%角叉菜胶致小鼠足趾肿胀的影响阳性对照组、四方木皮乙醇提取物各剂量组与空白组相比较，其能够在1、2、3、4 h 时，明显抑制小鼠足趾肿胀（P< 0.05 或P< 0.01），见表4。表明四方木皮乙醇提取物对1%角叉菜胶引起的小鼠足趾肿胀有明显的抗炎作用。

表4 四方木皮乙醇提取物对角叉菜胶致小鼠足趾肿胀厚度的影响（±s，n = 10）Tab.4 Effect of ethanol extract of Saracae Cortex on the thickness of carrageenan induced toe swelling in mice （±s，n = 10）

注：与空白组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。

组别剂量/（g/kg）给药前/mm给药后/mm 1 h2 h3 h4 h空白组—1.88±0.150.84±0.170.63±0.160.56±0.220.48±0.19阳性对照组 0.402.00±0.140.52±0.14**0.38±0.15**0.23±0.14**0.09±0.09**四方木皮乙醇提取物低剂量组 5.142.03±0.130.42±0.20**0.43±0.21*0.35±0.21**0.12±0.09**四方木皮乙醇提取物中剂量组10.271.94±0.110.53±0.18**0.43±0.12*0.30±0.12**0.14±0.13**四方木皮乙醇提取物高剂量组20.541.93±0.070.42±0.20**0.34±0.20**0.29±0.15**0.13±0.13**F 2.2729.2234.3745.42115.040 P 0.0760.0000.0050.0010.000

3.3 镇痛作用

3.3.1 四方木皮乙醇提取物对热刺激致小鼠疼痛的影响在观察期2 h 内，阳性对照组和四方木皮乙醇提取物三个剂量的药物组对热刺激的潜伏时间均未见明显增加（P＞ 0.05），见表5。结果表明，阿司匹林和四方木皮乙醇提取物对热刺激致小鼠疼痛效果均不明显。

表5 四方木皮乙醇提取物对热刺激致小鼠痛阈值的影响（±s，n = 10）Tab.5 Effect of ethanol extract of Saracae Cortex on pain threshold induced by heat stimulation in mice （±s，n = 10）

组别剂量/（g/kg）给药前/s给药后/s 30 min60 min90 min120 min空白组—17.21±3.4015.23±7.2315.45±4.2414.59±7.5316.05±7.42阳性对照组 0.4016.92±4.5919.21±6.9720.49±8.1119.52±8.4919.14±5.58四方木皮乙醇提取物低剂量组 5.1415.59±3.2317.46±7.5516.32±6.5017.68±6.6318.39±8.97四方木皮乙醇提取物中剂量组10.2719.55±2.4124.25±13.5322.98±12.8521.44±10.0219.91±11.63四方木皮乙醇提取物高剂量组20.5415.05±3.6720.90±7.8018.08±7.0918.92±7.8820.02±6.99 F 0.5942.2761.7702.1262.288 P 0.6690.0760.1520.0930.075

3.3.2 四方木皮乙醇提取物对醋酸致小鼠扭体反应的影响阳性对照组、四方木皮乙醇提取物低、中、高剂量组对醋酸刺激所致小鼠扭体反应的抑制率分别为90.8%、47.4%、67.3%和47.6%，见表6。与空白组相比，四方木皮乙醇提取物不同剂量的药物组小鼠扭体次数均明显减少（P＜ 0.05 或P＜0.01），其中，中剂量组抑制效果最好，表明四方木皮乙醇提取物对醋酸引起的疼痛有明显的镇痛作用。

表6 四方木皮乙醇提取物对醋酸致小鼠扭体反应的影响（±s，n = 10）Tab.6 Effect of ethanol extract of Saracae Cortex on writhing reaction of mice induced by acetic acid （±s，n = 10）

注：与空白组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。

组别剂量/（g/kg）扭体次数抑制率/%空白组—38±13.1—阳性对照组 0.403.9±4.5**90.8±12.8**四方木皮乙醇提取物低剂量组 5.1426.5±10.8*47.4±20.8**四方木皮乙醇提取物中剂量组10.2719.3±7.9**67.3±27.6**四方木皮乙醇提取物高剂量组20.5424.1±9.9**47.6±8.2**F 16.80840.042 P 0.000 0.000

4 讨论

豆科植物中起抗炎镇痛作用的物质主要为黄酮类[17-18]、生物碱类[19]、酚酸类[20]等，本研究基于UPLC-MS/MS 技术定性鉴定出四方木皮中541 种化学成分，用生物网络分析预测四方木皮抗炎、镇痛的“成分-靶点”相互作用，结果显示抗炎镇痛物质52 种，黄酮类与酚酸类代谢物质占比较高，占比71.25%，表明四方木皮发挥抗炎镇痛作用可能与黄酮类与酚酸类物质相关。

炎症初期，局部血管扩张，血流速度加快，导致血管的静脉压升高，血浆里蛋白质和白细胞等物质从毛细血管滤出，渗透到组织液中，形成局部水肿，同时使局部组织液中渗透压增加，导致血浆中的液体进一步外渗。因此，在炎症初期，渗出和组织肿胀是重要的指标[21]。角叉菜胶引起的水肿是由最初的1 h内释放组胺和5-羟色胺引起的，到2.5 h 为了维持血管通透性增加从而短时间内释放缓激肽，2.5 ～ 6 h与释放前列腺素有关[22]。实验结果显示四方木皮乙醇提取物对肿胀发生后1 ～ 4 h具有较好的抑制作用，推测其抗炎机制可能是通过抑制组胺、5-羟色胺、缓激肽和前列腺素的合成和释放而起的作用。

炎症往往是伴随着疼痛产生，镇痛实验采用物理刺激模型（热板法）和化学刺激模型（醋酸扭体法)。在热板法中，以热刺激（55±0.5）℃小鼠出现舔后足的潜伏时间为检测指标，评价所测试药物的中枢镇痛作用，该实验方法只对通过中枢神经系统而发挥镇痛作用的药物敏感，而非甾体抗炎药（包括阿司匹林、吲哚美辛、地塞米松等）镇痛作用主要在外周，因此在该实验方法中没有明显的镇痛作用[23-24]。王泊宁等[25]通过对热板致痛动物模型的观察，与正常组相比，天南星-生姜水提物不能明显延长小鼠热板痛阈时间，提示该药中枢镇痛作用不明显，这可能与外周抗炎作用有关。实验结果显示，在热板致痛模型中，四方木皮乙醇提取物各剂量组和阿司匹林组均未能提高动物的痛阈值，提示四方木皮的镇痛作用可能与中枢环节的相关性不明显。