木犀草素抑制NF-κB 增敏TRAIL 诱导肝癌HepG2 细胞凋亡作用的研究

吴文明，侯雄军，何 洁，胡建新

［江西省人民医院（南昌医学院第一附属医院）药学部，江西 南昌 330006］

木犀草素为3’,4’,5,7-四羟基黄酮，广泛存在于各种天然药用植物和蔬菜果实中。木犀草素已被证明具有抗癌活性，如诱导细胞凋亡、细胞周期停滞及血管生成抑制等[1-2]。研究表明，木犀草素具有增敏（包括TRAIL 在内的TNF 家族凋亡分子诱导多种人癌细胞凋亡）的作用，其增敏作用与下调NF-κB 表达、上调DR5 水平、抑制蛋白激酶活性以及降解XIAP 有关[3-5]。木犀草素具有安全低毒的特点，使其成为化疗增敏剂的理想候选物[3]。目前，尚没有关于木犀草素通过抑制NF-κB 活性，从而增敏TRAIL 诱导肝癌HepG2 细胞凋亡的相关研究。因此，本研究以亚细胞毒性浓度的木犀草素为研究对象，探讨其抑制NF-κB 的活性，从而增敏TRAIL 诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的作用，为木犀草素联合TRAIL 临床治疗肝细胞肝癌提供理论基础和实验依据。

1 材料和仪器

1.1 细胞株

人肝癌HepG2 细胞（货号：CL-0103，武汉普诺赛科技有限公司）。

1.2 药物与试剂

木犀草素（HY-N0162，MCE）；TRAIL（C022，Novoprotein）；DMEM 培养基（含双抗，KGM12800S，凯基生物）；胎牛血清（A8020, Solarbio）；1× PBS（0.01M，pH = 7.4）（KGB5001，凯基生物）；CCK-8法细胞增殖检测试剂盒（KGA317，凯基生物）；Annexin V-APC/7-AAD 细胞凋亡试剂盒（AP105-100kit，联科生物）；细胞周期染色试剂盒（CCS102，联科生物）；BCA Protein Assay Kit（E-BC-K318-M，Elabscience）；Marker（#26617，美国赛默飞）；内参一抗：Mouse Anti-β-Actin（HC201，TransGen Biotech，1/2 000）；二 抗：HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG （H+L）（GB23301，Servicebio，1/2 000）；目的 一 抗：Mouse Anti NF-κB p65 （66535-1-Ig，Proteintech，1/500），Rabbit Anti IκBα（10268-1-AP，Proteintech，1/1 000），Rabbit Anti p-IκBα（AF2002，Affinity，1/1 000）；二抗：HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG （H+L）（GB23303，Servicebio，1/2 000）。

1.3 主要仪器

BPN-80CW 型CO2培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；MF53 型荧光倒置显微镜（广州市明美光电有限公司）；BBS-SDC 型超净工作台（山东博科科学仪器）；SuPerMax3100 型多功能酶标分析仪（上海闪谱生物科技有限公司）；NovoCyte 2060R 型流式细胞仪（ACEA Biosciences Inc.）；NP80 型紫外分光光度仪（NanoPhotometer）；DYY-8C 型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；WD-2102B 型全自动酶标仪及DYY-6C 型蛋白垂直电泳仪（北京市六一仪器厂）；Tanon-5200 型全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

取长势良好的细胞进行传代。操作如下：吸弃培养上清，1×PBS 洗净两次，0.25%胰酶消化，细胞变圆后终止消化，加入培养基轻轻吹打，然后将细胞悬液转移至10 mL 离心管中，离心后弃上清，加入培养基反复吹打至均匀。按1 ∶3 的比例，将细胞悬液分置于预备好的培养皿中，做好标记，置于CO2培养箱中培养，完成细胞传代。根据实验需要将细胞铺至6 孔板、96 孔板、6 cm 培养皿，按细胞传代方法，根据实验需要，将细胞进行稀释，以6 孔板每孔约2×105个细胞，96 孔板每孔约1×104个细胞，6 cm培养皿每皿约5×105个细胞种板，完全贴壁后即可进行下一步实验。

2.2 CCK8 法检测细胞增殖情况

取对数期细胞，以每孔1×104个细胞接种于96孔板，培养12 h 后，分别加入终浓度为200、100、75、50、25 μmol/L 的木犀草素，100、80、60、40、20 ng/mL 的TRAIL 以及50 μmol/L 木犀草素加不同终浓度的TRAIL，处理24 h，每孔加入10 μL CCK8检测试剂，37℃培养箱中孵育4 h；取出摇匀，在波长450 nm 下，测定每孔OD值，计算细胞存活率。

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡和周期情况

参照细胞凋亡检测试剂盒操作说明书及文献[6]：收集1 ～ 3×106个细胞，加1 mL PBS，1 500 r/min 离心3 min，洗净两次，取500 μL 预冷的1×Binding Buffer 重悬细胞，每管各加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7-AAD，轻微混匀，室温避光孵育10 min后，混匀，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。参照细胞周期检测试剂盒操作说明书及文献[7]：收集2×105～3×106个细胞，离心3 min，弃上清液；加入1 mL PBS，1 500 r/min 离心弃上清液；加入1 mL DNA 染色液和10 μL 渗透溶液，涡旋振荡5 ～ 10 s 混匀，室温避光孵育30 min，流式细胞仪检测分析细胞周期。

2.4 Western-Blotting 检测NF-κB 相关蛋白

参考文献[8]报道的方法，将培养皿中细胞培养液吸弃，加入100 μL 的细胞裂解液，冰上放置20 min。将细胞刮至一侧，液体转移至标记好的EP 管中，12 000 r/min 离心10 min，取上清，即为总蛋白，测定蛋白浓度。蛋白变性后上样，电泳2 h，在300 mA恒流转膜80 min。一抗孵育，4 ℃过夜；二抗室温孵育2 h。膜上滴加发光液，凝胶成像系统中曝光，用Image Pro 软件分析各条带灰度值。

2.5 统计学方法

用SPSS 23.0 软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 木犀草素与TRAIL 对HepG2 细胞增殖的影响

分别用不同浓度的木犀草素和TRAIL处理HepG2细胞24 h，结果显示，木犀草素在25 ～ 200 μmol/L的浓度范围内皆有抑制HepG2 细胞增殖的作用，见图1。这与文献[9]报道的一致。其抑制率分别为5.04%、11.67%、26.88%、45.46% 和84.10%，因此选择亚细胞毒性浓度50 μmol/L 的木犀草素作为本次研究的对象。TRAIL 在20 ～ 100 ng/mL 浓度范围内对HepG2 细胞的增殖亦表现出一定的抑制作用，抑制率分别为6.61%、10.30%、14.98%、16.19%和16.32%。将50 μmol/L 木犀草素分别和不同浓度的TRAIL 共同作用于HepG2 细胞。结果显示，50 μmol/L 木犀草素和20 ng/mLTRAIL 对诱导HepG2 细胞生长的抑制率最小 （P＜ 0.05），协同因子达到1.802，见表1。因此，选定 50 μmol/L 的木犀草素和20 ng/mL 的TRAIL 进行接下来的实验研究。

表1 50 μmol/L 的木犀草素和不同浓度TRAIL 联合用药对HepG2 细胞生长的抑制率及协同因子的影响（n = 3）Tab.1 Growth inhibition rates of HepG2 cellsand co-factors treated with 50 μmol/L luteolin in combination with various concentrations of TRAIL（n = 3）

图1 不同浓度的木犀草素与TRAIL 对HepG2 细胞增殖的影响Fig.1 Effects of different concentrations of luteolin and TRAIL on proliferation of HepG2 cells

3.2 各实验组对HepG2 细胞凋亡及周期的影响

空白对照组细胞的自然凋亡率为4.80%，而由50 μmol/L 的木犀草素引起的HepG2 细胞凋亡率为20.80%，明显高于空白对照组（P＜0.05），且主要是晚期凋亡。20 ng/mL TRAIL 引起的HepG2 细胞凋亡亦主要是晚期凋亡，凋亡率为11.46%。与空白对照组、木犀草素组和TRAIL 组相比，木犀草素+TRAIL 组引起的HepG2 细胞凋亡率明显上升为41.91%（P＜0.05），主要为早期凋亡，见图2A。

图2 各实验组对HepG2 细胞凋亡（A）及周期（B）的影响Fig.2 Effects of different experimental groups on apoptosis（A）and cycle（B）of HepG2 cells

空白对照组的G0/G1期、S 期和G2/M 期的细胞数分别占比57.12%、30.54%和12.34%。与空白对照组相比，TRAIL 组细胞各周期细胞数无明显变化；木犀草素组G0/G1期细胞数量减少为46.14%，S 期和G2/M 细胞数量增加，分别为39.49%和14.37%。与空白对照组和单独用药组相比，木犀草素+TRAIL 组G0/G1期和G2/M 期细胞数量减少，分别占比30.98%和11.30%，S 期细胞明显增加，占比57.72%，细胞停滞于S 期，见图2B。

3.3 各实验组对HepG2 细胞NF-κB 相关蛋白的影响

与空白对照组相比，木犀草素组IκBα、p-IκBα和NF-κB p65 蛋白表达下降（P＜0.05），TRAIL组IκBα、p-IκBα 和NF-κB p65 表达上升；与空白对照组和单独用药组比较，木犀草素+TRAIL组IκBα、p-IκBα 和NF-κB p65 蛋白均下降 （P＜0.05），见图3。结果表明，木犀草素能够抑制IκBα 磷酸化，从而抑制NF-κB 的活化；而木犀草素与TRAIL 合用，IκBα、p-IκBα 和NF-κB p65 蛋白表达下降更甚，说明对NF-κB 的抑制更强。

图3 各实验组对HepG2 细胞NF-κB 相关蛋白的影响Fig.3 Effects of different experimental groups on NF-κB-related proteins in HepG2 cells

4 讨论

TRAIL 具有广谱、高效、特异的诱导肿瘤细胞凋亡的作用，并且对正常细胞没有杀伤作用。60%的肿瘤细胞对TRAIL 诱导的凋亡并不敏感，但TRAIL与化疗药物联合应用时对大多数肿瘤细胞表现出协同杀伤效应，具有较好的应用前景[11-13]。本研究结果显示，HepG2 细胞经TRAIL 处理24 h 后出现了凋亡，说明TRAIL 具有一定的诱导HepG2 细胞凋亡的作用，这与相关文献[3-4]报道的一致。但有文献报道，经TRAIL 处理的肝癌细胞其Bcl-2 和Bcl-XL 等抗凋亡蛋白表达上调，而促凋亡蛋白Bax、Bcl-Xs 表达下降，这可能与NF-κB 的活化有关[14-15]。本研究发现，经TRAIL 处理后，细胞内的NF-κB 蛋白表达增加，而NF-κB 又能导致cIAP-1、cIAP-2、XIAP、cFLIP、Bcl-XL 和TRAIL-R3 等抗凋亡蛋白表达上调，从而抑制肝癌细胞的凋亡，这是大多数肿瘤细胞对TRAIL 诱导的凋亡不敏感的一个因素[11]。因此，抑制NF-κB 的活化，增敏TRAIL 诱导HepG2细胞的凋亡值得进一步研究。

在正常情况下，NF-κB 与其抑制蛋白IκB 以聚合体的形式存在于细胞质内，无转录活性；当受到外界刺激时，IκB 发生磷酸化水解，并与NF-κB分离，NF-κB 被释放转位进入细胞核，从而引起特定靶基因的表达，促进肿瘤的形成和进展[16]。目前，已有大量的研究证明，通过下调NF-κB 的表达能够诱导肝癌细胞的凋亡[17-19]。因此，抑制IκB 的降解以及NF-κB 的活性，是诱导肝癌细胞的凋亡的一个重要靶点[20]。目前，木犀草素已被证实具有抑制肝癌HepG2 细胞NF-κB 活性，与TRAIL 合用能否增敏TRAIL 诱导HepG2 细胞凋亡是本研究的重点。研究结果显示，亚细胞毒性的木犀草素与TRAIL 联合应用后，细胞凋亡程度明显高于单独使用TRAIL 组。同时，Western Blotting 实验结果显示，两者联合应用后，木犀草素组、木犀草素+ TRAIL 组中IκB、p-IκB和NF-κB 蛋白明显降低，表明木犀草素能抑制IκB 的磷酸化，使NF-κB 无法被激活，降低了药物抵抗性，从而增强了TRAIL 诱导细胞凋亡的作用，这可能是木犀草素增敏TRAIL 诱导肝癌HepG2 细胞凋亡的一个重要因素。

5 结论

木犀草素与TRAIL 合用可以抑制HepG2 细胞IκBα 的磷酸化，从而抑制NF-κB 活化，抵抗TRAIL激活NF-κB的作用，增加HepG2细胞对TRAIL的敏感性，促进HepG2 细胞凋亡。然而NF-κB 被抑制后，cIAP-1、cIAP-2、XIAP、cFLIP、Bcl-XL 等抗凋亡蛋白和Bax、Bcl-Xs 等促凋亡蛋白的表达尚无相关研究，这可能与木犀草素增敏TRAIL诱导肝癌HepG2细胞凋亡的机制有关，有待进一步探究。木犀草素与TRAIL 合用，不仅可以减少木犀草素在抗肿瘤中的用量，降低对正常细胞的细胞毒性，也为木犀草素联合TRAIL 在临床治疗肝癌提供理论基础和实验依据，为开发具有增敏TRAIL 诱导肿瘤细胞凋亡的药物提供实验思路。