定向敲除SD1基因提高水稻的抗倒性和稻瘟病抗性

李刚 高清松 李伟 张雯霞 王健 程保山 王迪 高浩 徐卫军 陈红旗 纪剑辉, *

定向敲除基因提高水稻的抗倒性和稻瘟病抗性

李刚1, #高清松2, #李伟2张雯霞2王健1程保山1王迪1高浩1徐卫军1陈红旗3, *纪剑辉2, *

(1江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所/淮安市农业生物技术重点实验室，江苏 淮安 223301;2淮阴师范学院/江苏省环洪泽湖生态农业与生物技术重点实验室, 江苏 淮安 223300;3中国水稻研究所水稻生物育种全国重点实验室, 杭州 311401;*通信联系人, email: chqhzfy@126.com, jijianhui@hytc.edu.cn)

【目的】为改良高产粳稻品种淮119株高偏高及易感稻瘟病等不利性状，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对淮119中基因进行定向敲除，为淮119后代品种改良奠定基础。【方法】利用CRISPR/Cas9系统，以基因为靶基因，构建基因敲除载体，以农杆菌介导转化淮119，获得无转基因插入的纯合突变株，进一步对纯合突变株株高、农艺性状、稻瘟病抗性及氮素吸收利用能力等进行综合分析。【结果】利用农杆菌转化淮119，鉴定获得1株无转基因载体序列插入的纯合突变株。大田种植发现，野生型淮119出现60%面积以上的倒伏，而纯合突变株群体由于株高变矮，从而有效避免了生育后期的倒伏。此外，用不同浓度的GA（0.01～1.00 μmol/L）处理，野生型苗高均显著高于突变株，表明突变导致对外源GA敏感性降低。稻瘟病抗性鉴定结果表明，基因突变不仅有效降低株高，同时增强了对稻瘟病的抗性水平。不利因素是，基因的敲除降低了淮119的氮素吸收利用效率。【结论】淮119中基因定向敲除获得的无转基因插入纯合突变株，不仅株高显著下降，且稻瘟病抗性得到增强。

CRISPR/Cas9；基因编辑；；稻瘟病；抗倒性；水稻

发展现代农业，提高作物的产量和品质，离不开优良作物品种的鉴定和选育[1]。相比传统杂交的长周期和诱变育种的随机性，基因组定向编辑技术对特定靶基因进行精确修饰，在作物基因功能研究和品种改良过程中具有广阔的应用潜力。CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9) 基因组编辑技术，具有操作简便、成本低、效率高等优点。该技术只需表达Cas9核酸酶和一个经过设计的单导向RNA(sgRNA)，就可以完成对基因组特定位点的切割，其序列特异性通过改变sgRNA中20个核苷酸的引导序列而实现[2-5]。随后，切割造成的DNA双链断裂可通过非同源末端连接和同源重组两种方式进行修复。目前，该技术已在各种植物的基因编辑中广泛应用，并为作物育种带来了一场技术革命[6-8]。

水稻“绿色革命”基因()编码赤霉素(GA)合成途径的关键酶GA20氧化酶，参与GA合成的最后步骤[9, 10]。该基因的突变降低了水稻GA水平，导致株高适度下降而防止倒伏，显著增加了水稻产量[10-12]。在基因的利用方面，李铮友先生曾历时5年将-383突变回交至云南品种毫木西和毫秕等软米中，育成滇屯及滇瑞优质软米品种[13]。近年来，研究人员利用CRISPR/Cas9技术对优良水稻品种中的基因进行定向编辑，创制出多个新的等位基因，大大丰富了该座位的遗传多样性[14-16]。等[14]采用相同的靶点，对3个优良水稻品种中的基因进行编辑，获得了株高显著下降但产量增加的育种材料。Hu等[15]对Kasalath和特特普中的基因进行编辑，发现突变株株高显著下降，且其稻瘟病抗性提高。胡雪娇等[16]在基因第1外显子设计靶点，对恢复系申繁17和申繁24进行编辑，发现突变株株高下降了25%，且其他农艺性状无显著变化。

学者们研究发现，GA与水稻稻瘟病抗性密切相关。黎起秦等[17]发现赤霉素对水稻抗瘟性的影响与表皮结构和生理生化特性有关。稻株在喷洒赤霉素后，由于稻秆节间伸长，且表皮硅化细胞数目减少，角质层和表皮层的厚度变薄，使稻瘟病菌易于入侵。赤霉素20-氧化酶（GA20ox）在GA生物合成途径中，催化后期的一系列氧化反应。水稻中有4个相关基因对进行干扰后获得的株系，表现为对稻瘟病菌和白黄单胞杆菌（叶枯病）抗性增强，且防御相关基因的表达上调，而-过表达株系对这些病原体更敏感[18]。水稻基因编码1个GA信号受体，在的突变体中，赤霉素合成酶基因表达下调，而植物抗毒素合成酶基因和的表达却上调，提示与水稻耐受冷胁迫和抗稻瘟病有关[19]。基因编码细胞色素P450单加氧酶。基因的突变降低了水稻对白叶枯病和稻瘟病的抗性，而基因的过表达则增强抗病性，表明GA对水稻的抗病性起负调控作用[20]。胡兴明等[15]在特特普中敲除基因后获得的半矮秆株系稻瘟病广谱抗性不仅没减弱，反而有一定程度增强。目前为止，赤霉素与稻瘟病抗性相关的分子机制还需要进一步深入研究。

淮119是由江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所育成的高产型粳稻品种，因其具有产量高、米质好、种植区域广等优点，在江苏苏中稻区受到广大种植户的欢迎。但淮119株高偏高(平均达到109 cm)，导致在高产栽培时容易倒伏，且易感稻瘟病，影响了该品种在生产上大面积推广应用。本研究对淮119中基因进行定向基因编辑，并对纯合突变株株高、农艺性状、稻瘟病抗性和氮素吸收利用能力等进行系统分析，旨在为后期育种材料的培育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 靶点设计、基因敲除载体构建和水稻遗传转化

利用CRISPR-P 2.0网站的在线分析功能(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)，在基因第一外显子区域设计基因敲除靶标位点[21]。合成基于CRISPR/Cas9系统的靶序列引物SD1-P1和SD1-P2(表1)，退火后连入BGK032双元载体，得到靶向靶标位点的重组表达载体。经生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证正确后，利用农杆菌介导法转化水稻淮119，获得转基因再生植株。

1.2 靶位点突变的检测

采用CTAB法提取转基因植株DNA，利用基因组引物(SD1-F/R)进行PCR扩增覆盖靶标位点的DNA片段，扩增后测序。利用在线基因编辑分析程序(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)[22]对转基因植株后代进行鉴定，获得纯合突变株。引物序列见表1。

1.3 转基因的分离

利用、和等3个基因的引物对T1纯合转基因植株的DNA进行扩增，以基因作为参照，获得无转基因插入的纯合突变株。引物序列见表1。

1.4 外源GA处理

水稻种子萌发后挑选生长一致的幼苗，接种于水培盒中，分别加入0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/ L GA溶液，于14 h光照/10 h黑暗光周期、30℃/25℃温度周期光照培养箱中生长，分别在第7天和第10天测量幼苗苗高。

1.5 稻瘟病自然诱发和人工接种鉴定

稻瘟病自然诱发鉴定点位于江苏省连云港市赣榆区塔山镇，为稻瘟病重发区。供试材料于5月中旬播种，6月中旬移栽，每份材料种植6行36株，设置3次重复。于10月中旬依据农业农村部发布的行业标准NY/T 2646–2014《水稻品种试验稻瘟病抗性鉴定与评价技术规程》进行病情调查和病级评价[23]。稻瘟病鉴定综合指数采用以下公式计算：

综合指数=叶瘟病级×25%+穗瘟发病率病级×25%+穗瘟损失指数病级×50%。

人工接种鉴定菌液引自江苏省农业科学院植保所植物病理学实验室。2021年正季从江苏省各稻区采集和分离稻瘟菌株，并经过24个近等单基因系鉴定，选用其中5个具有代表性的菌株作为鉴定用菌株。在产孢培养基上25℃下黑暗培养7 d、黑光灯照射72 h，刮取5个菌株的孢子等比例混合，配制成终浓度为1×105个/mL的孢子悬浮液[24]。待水稻生长至剑叶叶枕距为2～3 cm时，用注射器将1 mL悬浮液注射进穗苞，待成熟期观察发病病症。

1.6 氮素吸收利用率鉴定

1.6.1 种子萌发期氯酸钾溶液处理

将露白的野生型和突变体种子放置于铺有滤纸的培养皿中，加入0.02%的氯酸钾溶液，于14 h光照/10 h黑暗光周期、30℃/25℃温度周期下萌发，溶液每两天更换1次，7 d后测量幼苗的苗高，以蒸馏水处理的种子为对照。

1.6.2 幼苗期氯酸钾溶液处理

将野生型和突变体幼苗在木村B营养液中生长10 d，加入0.5 mmol/L的氯酸钾溶液，每两天更换营养液，以木村B营养液培养的幼苗为对照。培养7 d后拍照观察，并参照Arnon法测定幼苗叶片的总叶绿素和类胡萝卜素含量[25]。

1.7 田间试验与统计分析

在2021年夏季的田间试验中，对无转基因插入的T3代突变体与野生型淮119进行小区测产和表型分析，每个小区10 m2，设置3个小区重复。

利用Excel 2016进行统计分析，采用t检验检测野生型与突变体间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 淮119中SD1基因敲除纯合突变株的获得

基因()含有3个外显子，编码区包含1170个核苷酸，编码1个由389个氨基酸组成的蛋白质。已有研究表明，的自发突变主要发生在第1和第2外显子区域[10]。我们在基因的第1外显子区设计了1个特异靶标位点进行CRISPR/Cas9基因敲除(图1-A)。该靶标位点在水稻基因组中共含有12个潜在的脱靶位点，除脱靶位点7含有3个错配以外，其余脱靶位点均含有4个错配(图1-B)。合成基于靶标序列的引物，退火后插入BGK032双元载体。该载体的T-DNA区段结构如图1-C所示。测序验证正确后，利用农杆菌介导法转化淮119，共获得5株转基因T0植株。

利用一对覆盖靶标位点的引物对转基因植株进行PCR扩增和序列测定，发现5株转基因植株中有1株带有杂合突变，其余4株均无突变。通过利用、sgRNA和三个基因的引物扩增，结合靶位点的测序鉴定，在杂合突变体的后代中获得了1株无转基因插入的纯合突变株。该突变株在第1外显子带有4 bp的缺失，从而导致后续氨基酸编码序列移码，我们将其命名为(图1-D)。

表1 本研究中使用的引物序列

2.2 淮119中SD1基因突变导致株高显著下降

田间试验测产和表型分析发现，突变体平均株高为77.0 cm，相比淮119显著下降了29.1%(图2-A、图3-A)；突变体每株穗数(图2-B)和每穗粒数(图2-C)与对照无显著差异。测产发现突变株群体小区产量与淮119相当，无显著差异(表2)。突变株无倒伏发生(图3-C)，而淮119出现了大面积倒伏，倒伏比例为60%～90%(表2、图3-B)。

***P<0.001.

表2 野生型淮119及sd1突变体群体产量及其倒伏比例

图3 淮119中sd1突变株表型及抗倒伏性分析

为研究突变体对外源GA的应答，我们在水培条件下，对野生型和突变体进行了不同浓度的GA处理，7 d和10 d后测量苗高。结果发现(图4-A)，处理7 d后，在0.01μmol/L GA处理下，野生型淮119苗高与空白对照出现显著差异，而突变体在GA浓度大于0.1 μmol/L后与空白对照出现显著差异。随着GA处理浓度的升高，野生型与突变株的苗高差异进一步显著，但在10 μmol/LGA浓度下，两者的差异缩小。处理10 d后，野生型和突变株的株高变化趋势与7 d处理后保持一致。这些结果表明，GA对野生型淮119及纯合突变株的生长均有促进作用，但两个材料对GA处理的反应差异显著，突变体对外源GA处理较野生型敏感性降低。

A—GA处理7 d; B—GA处理10 d. *表示突变体与野生型间的差异达0.05显著水平(n=4)。

图5 sd1突变体与野生型穗颈瘟的抗性比较

2.3 SD1基因突变提高了淮119对穗颈瘟的抗性

GA不仅调控植物的生长发育，在植物对逆境胁迫的响应中也发挥了重要作用。外源施用GA易加重稻瘟病的发生，而降低内源GA含量有助于提高水稻对稻瘟病的抗性[10]。为研究基因突变是否影响水稻稻瘟病的抗性，在稻瘟病重发区进行自然诱发鉴定及孕穗期混合菌液人工接种鉴定。结果表明，自然诱发点突变株穗发病率为23%，最高病级5级，穗损失指数仅6%，根据公式测算突变株稻瘟病综合指数为3.00，病级3级，属中抗(MR)等级；而野生型淮119穗发病率为82%，最高病级9级，穗损失率为33%，根据公式测算突变体稻瘟病综合指数为6.25，病级7级，属感病(S)等级(表3)。人工接种后的突变体穗颈节间和枝梗仍呈绿色，结实未受显著影响，而野生型植株穗颈节间和枝梗均呈褐色，结实受到了严重影响，穗上多数籽粒为秕粒(图5)。这些结果表明，基因的突变不仅有效降低了株高，同时增强了淮119对稻瘟病的抗性。

2.4 淮119中SD1基因突变引起氮素吸收利用能力下降

植物对硝酸盐和氯酸盐的吸收具有相似性。硝酸钾是植物的氮源之一，而氯酸钾对植物有毒害作用。基于这一原理，分别在种子萌发期和幼苗生长期进行氯酸钾溶液培养实验，利用氯酸钾对幼苗发育和生长的影响，间接反映供试材料对硝酸盐的吸收能力差异[26]。为研究基因突变是否影响水稻的氮素吸收利用能力，我们对野生型淮119及其突变体进行了氯酸盐处理下的萌发实验。结果表明，清水培养条件下野生型淮119与突变体的苗高无显著差异，但氯酸钾处理下突变体苗高显著高于野生型(图6-A和6-B)。氯酸钾处理水稻幼苗后期，野生型植株叶片上部枯死，而突变体仍保持着较好的长势(图6-C)。叶片色素含量分析表明，清水培养条件下野生型和突变体总叶绿素和类胡萝卜素含量无显著差异，但氯酸钾处理下突变体总叶绿素和类胡萝卜素含量均显著高于野生型(图6-D和6-E)。这些结果表明，基因突变降低了水稻对氯酸钾的吸收能力，间接证明了突变体的氮素吸收利用能力下降。

表3 sd1及淮119对水稻不同时期稻瘟病的抗性鉴定结果

3 讨论

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在作物遗传改良中具有广阔的应用前景[16, 27]。本研究利用CRISPR/Cas9技术，对水稻品种淮119的基因进行敲除，获得了无转基因插入、株高显著下降且稻瘟病抗性增强，能在后期育种中直接使用的纯合突变材料。

长期以来，虽然水稻生产水平有了很大提高，但是倒伏问题始终制约着水稻的高产和优质化发展。一旦发生大面积倒伏，将会导致减产及稻米品质大幅下降，同时增加收割成本[16, 27]。2021年水稻灌浆期温光条件较好，淮119灌浆充分、结实率高、产量潜力大，但由于株高偏高，收获前突来的台风引起了该品种大面积“地毯式”倒伏，机械收割困难，产量损失非常严重。因此，亟待增强水稻品种的抗倒伏能力。水稻“绿色革命”基因基因编码GA20氧化酶，参与GA的合成。自然突变体中活性GA含量下降，引起株高降低，分蘖数和收获指数增加[10, 28]。Hu等[15]利用CRISPR/Cas9技术敲除Kasalath和特特普中的基因，发现突变体对外源GA的应答与野生型无显著差异，表明基因编辑突变体株高的下降与自然突变体相似，也是由于GA缺失引起的。本研究突变体对外源GA敏感性比野生型降低，表明其株高下降主要由活性GA含量下降引起。GA含量与水稻的稻瘟病抗性密切相关，干扰GA合成途径相关基因可能进一步增强水稻对稻瘟病菌抗性[17, 18]。本研究中淮119对稻瘟病为感病表型，而其基因编辑突变体的抗性显著增强，表明对基因进行基因编辑有望同步降低水稻株高和改良水稻对稻瘟病的抗性。

含有等位基因的半矮秆水稻品种通常对氮肥不敏感，造成氮素利用率下降[29, 30]。因此，必须使用大量的氮肥才能保证这些品种的产量水平。为研究淮119中基因编辑是否影响该品种的氮素吸收利用能力，我们对野生型淮119和突变体进行了氯酸盐处理实验。结果表明，突变体的氮素吸收利用能力显著低于野生型。由于大量施用氮肥会造成土壤酸化、水体富营养化等严重的环境问题，如何在利用基因降低水稻株高、提高收获指数、保证产量水平的同时，改良半矮秆品种的氮素吸收利用能力，是摆在水稻遗传育种工作者面前的紧要任务。

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Directed Knockout ofGene Improves Lodging Resistance and Blast Resistance of Rice

LI Gang1, #, GAO Qingsong2, #, LI Wei2, ZHANG Wenxia2, WANG Jian1, CHEN Baoshan1, WANG Di1, GAO Hao1, XU Weijun1, CHEN Hongqi3, *, JI Jianhui2, *

(Huaiyin Institute of Agricultural Science in Xuhuai Region of Jiangsu/Huai'an Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, Huai'an 223001, China; Jiangsu Key Laboratory for Eco-Agricultural Biotechnology Around Hongze Lake, Huaiyin Normal University, Huai’an 223300, China; State Key Laboratory of Rice Biological Breeding Biology, China National Rice Research Institute,Hangzhou 311401, China; Corresponding author, email: chqhzfy@126.com; jijianhui@hytc.edu.cn)

【Objective】Huai 119 is a high-yieldingrice variety. To improve its unfavorable traits, especially high plant height and poor resistance to rice blast, we used the CRISPR/Cas9 gene editing technology to knock out its ‘Green Revolution’ gene.【Method】We selected thegene as the target to construct the CRISPR/Cas9 gene knockout vector, which was then transformed intoHuai 119 by-mediated transformation method, and the homozygousknockout line without transgenic insertion was obtained. Subsequently, we compared and analyzed the plant height, rice blast resistance, and nitrogen uptake and utilization efficiency of theand wild-type lines.【Result】We successfully isolated a homozygousknockout line without transgenic insertion in the background of Huai 119. In field paddy, it was found that over 60% of the planting area of wild-type Huai 119 was lodging, while thehomozygous mutant population effectively avoided lodging in the later stages of growth due to its shorter plant height. In addition, after treatment with different concentrations of GA (0.01-1.00 μmol/L), the plant height increase of wild-type plants was significantly greater than that of theline, indicating that the sensitivity ofline to exogenous GA treatment was reduced. The identification of rice blast resistance shows that knocking outalso contributed to the improvement of rice blast resistance of Huai 119. However, the absorption and utilization efficiency of nitrogen decreased due to the knockout of. 【Conclusion】The knockout ofgene in the rice variety Huai 119 not only improves lodging resistance by reducing plant height, but also enhances the resistance to rice blast.

CRISPR/Cas9; gene editing;; rice blast; lodging resistance; rice

10.16819/j.1001-7216.2023.221113

2022-11-24;

2023-02-08。

淮安市自然科学基金项目(HAB202076)；江苏省重点研发计划资助项目(BE2021334、BE2021323)；江苏省农业科技自主创新资金资助项目[CX(22)3157]；国家自然科学基金资助项目(32070345)；江苏省自然科学优秀青年基金项目(BK20180107)。