7 种生物药剂对铁皮石斛层出镰刀菌的生物活性及其协同作用

刘惠芳，田旭军，王晓敏，肖彩云，李荣玉

（1.贵州省农业科学院 茶叶研究所，贵州 贵阳 550006；2.贵州大学 作物保护研究所，贵州 贵阳 550025；3.贵州省亚热带作物研究所，贵州 兴义 562400）

铁皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）属兰科石斛属（Dendrobium）草本植物，是一种珍贵的中药材，富含丰富的单糖、多糖、多酚、生物碱等多种成分，具有抗氧化、调节免疫力和降血糖等多重功效，被称为九大仙草之首，具有重要的药用价值和经济价值[1-5]。作为贵州十二大特色农业产业之一的铁皮石斛发展较快，截至2022 年底，贵州石斛栽培面积约10 666.7 hm2，其中铁皮石斛面积约4 520 hm2[6-8]。但随着铁皮石斛人工种植规模的扩大，病害的发生也越来越严重，其中由终极腐霉（Pythium ultimum）、细菌类欧式杆菌（Erwinia）和层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）等病原菌引起的软腐病成为铁皮石斛重要的病害之一，病原菌主要侵染铁皮石斛的茎基部和茎，导致铁皮石斛枯萎死亡[9]。该病全年均有发生，严重影响铁皮石斛的产量和质量。由于铁皮石斛药用的特殊性，化学农药的使用受到限制[10-11]。因此，铁皮石斛软腐病的防治手段主要包括选用抗病品系，对幼苗进行严格检疫，加强栽培管理、创造良好的生长条件以及进行生物防治[12]。目前，对铁皮石斛病害的防控研究主要集中在田间病害调查和药剂筛选等方面。如谢显彪等[13]明确了吡萘·嘧菌酯、肟菌·戊唑醇对石斛锈病具有较高的田间防效；沈伟东等[14]筛选出对铁皮石斛轮纹病病原菌露湿漆斑菌菌丝生长具有较好抑制作用的药剂有4 种，分别为春雷霉素、氟菌·肟菌酯、吡萘·嘧菌酯和甲基硫菌灵；而关于铁皮石斛层出镰刀菌的研究相对较少，且报道的低毒高效药剂主要有福·福锌、咪鲜胺和吡唑醚菌酯等[15]。为此，测定了7 种生物药剂对铁皮石斛层出镰刀菌的毒力及其较好药剂的协同作用，以期为铁皮石斛田间病害防治提供药剂选择和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试病原菌 铁皮石斛层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）：2019 年从贵州兴义采集铁皮石斛软腐病病株，经分离纯化得到，保存于贵州大学农学院农安实验室[16]。

1.1.2 供试生物药剂 0.3%丁子香酚可溶液剂（A，简称丁子香酚，南通神雨绿色药业有限公司）、0.5%大黄素甲醚水剂（B，大黄素甲醚，内蒙古清源保生物科技有限公司）、1%蛇床子素水乳剂（C，蛇床子素，内蒙古清源保生物科技有限公司）、0.3%四霉素水剂（D，四霉素，辽宁微科生物工程股份有限公司）、12%中生菌素可湿性粉剂（E，中生菌素，福建凯立生物制品有限公司）、6%春雷霉素可湿性粉剂（F，春雷霉素，华北制药河北华诺有限公司）、1%申嗪霉素悬浮剂（G，申嗪霉素，上海农乐生物制品股份有限公司）。

1.1.3 供试培养基 PDA 培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、纯净水1 000 mL；煮好后放入HIRAYAMA 灭菌器中，在温度为121 ℃的条件下灭菌20 min，冷却至50 ℃左右备用。

1.1.4 仪器设备 HIRAYAMA-50 灭菌器（日本HIRAYAMA 公司）、SJ-CJ-2FD 超净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）、BIC-400 人工气候箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、10 mL 离心管、1 mL和5 mL移液枪、10 mL量杯、9 mm培养皿等。

1.2 方法

1.2.1 层出镰刀菌对7 种生物药剂的敏感性测定

采用菌丝生长速率法[16-17]测定丁子香酚、春雷霉素和大黄素甲醚等7种生物药剂对铁皮石斛层出镰刀菌的毒力。将药剂根据所设质量浓度梯度用无菌水配制成含丁子香酚1、3、9、27、81 μg/mL，含大黄素甲醚40、120、360、1 080、3 240 μg/mL，含蛇床子素15、45、135、405、1 215 μg/mL，含四霉素2、8、14、20、26 μg/mL，含中生菌素40、80、160、320、640 μg/mL，含春雷霉素120、360、1 080、3 240、9 720 μg/mL，含申嗪霉素3、15、27、39、51 μg/mL 的不同质量浓度母液。将培养基和药剂以体积比为9∶1倒入直径9 mm 的培养皿中，制成含药PDA 平板。并将培养好的层出镰刀菌用直径5 mm 的打孔器沿菌落边缘进行打孔，接种至含不同药剂的PDA 平板中央，以不含药剂的PDA 平板作为空白对照，每个处理重复3 次，置于温度28 ℃、湿度40%、黑暗的人工气候箱中培养5 d。待菌丝生长至培养皿2/3 时采用十字交叉法测量菌落直径。取其平均值作为最终的菌落直径，用公式（1）计算菌丝生长抑制率。对各处理浓度对数（X）与抑制率值（Y）进行回归分析，利用DPS 18.10 进行统计分析，计算有效抑制中浓度（EC50）和毒力回归方程。

1.2.2 生物药剂组合对铁皮石斛层出镰刀菌的协同作用测定 参考赵琪君等[18]的方法，测定不同组合对层出镰刀菌的毒力。根据单剂的EC50值，设置丁子香酚、蛇床子素、四霉素和申嗪霉素的不同组合（质量比9∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶9）进行联合毒力测定，筛选最佳混配组合。按照1.2.1的方法制作含药PDA 平板。将培养好的层出镰刀菌用直径5 mm 的打孔器沿菌落边缘进行打孔，用接种针将菌饼菌丝面朝下接种到含药PDA 平板中央，以不含药剂的PDA 平板作为空白对照，每个处理重复3 次。置于温度28 ℃、湿度40%、黑暗的人工气候箱中培养5 d。待菌丝生长至培养皿2/3时采用十字交叉法测量菌落直径。取其平均值作为最终的菌落直径，并计算单剂及各比例的EC50值。根据孙云沛法[19]进行数据处理，将各处理的EC50值换算实际毒力指数（ATI）；根据组合比例，计算理论混用毒力指数（TTI）。按照公式（2）（3）（4）（5）计算各组合各比例的共毒系数（CTC）[20]。

并根据孙云沛法判断各组合各比例是否对铁皮石斛软腐病菌层出镰刀菌具有增效作用。若CTC≤80，为拮抗作用；80～120 为相加作用；≥120 为增效作用。

1.2.3 生物药剂组合对铁皮石斛软腐病的室内防治试验 采用针刺法[21]测定丁子香酚+蛇床子素、蛇床子素+申嗪霉素和蛇床子素+四霉素对铁皮石斛软腐病的防治效果。依据药剂推荐浓度，将丁子香酚、蛇床子素、四霉素和申嗪霉素分别稀释至2.7、12.78、1.66 μg/mL 和0.59 μg/mL，同时设置处理丁子香酚+蛇床子素（使用剂量为2.57+0.29 μg/mL）、蛇床子素+四霉素（0.62+0.62 μg/mL）、蛇床子素+申嗪霉素（0.63+0.08 μg/mL）。选取大小一致的铁皮石斛幼苗移入育苗盆钵中，待其直立、生长正常后，用75%的乙醇对针进行表面消毒，然后刺伤铁皮石斛的茎基部1～2次，刺伤但不能穿透，用直径5 mm 的打孔器沿培养好的层出镰刀菌边缘进行打孔制作菌饼。治疗作用测定：将菌饼接到伤口，使铁皮石斛发病到3 级左右，取5 mL 药剂进行喷施处理，每个处理重复3次，在喷药后3、7、14 d分别调查各处理的发病情况。分级标准为，0 级：无病斑；1级：病斑直径为茎部圆周的1/8 以下；3 级：病斑直径为茎部圆周1/8～1/4（含1/8）；5 级：病斑直径为茎部圆周1/4～1/2（含1/4）；7 级：病斑直径为茎部圆周1/2～3/4（含1/2）；9 级：病斑直径为茎部圆周3/4～1（含3/4）。按照公式（6）和（7）计算相应的防效。

预防作用测定：先进行喷药处理，待药剂干燥后，用75%的乙醇对针进行表面消毒，然后刺伤铁皮石斛的茎基部1～2 次，并将菌饼接到伤口。调查方法及调查时间与治疗作用测定一致。

1.2.4 生物药剂组合对铁皮石斛软腐病的田间防治试验 试验在贵州省兴义市进行，选取1 年生且长势一致的铁皮石斛进行田间防效试验。各处理分别为0.3% 丁子香酚可溶液剂（有效成分用量0.24 g/hm2）、1%蛇床子素水乳剂（0.50 g/hm2）、0.3%四霉素水剂（0.15 g/hm2）、1% 申嗪霉素悬浮剂（1.00 g/hm2）、丁子香酚+蛇床子素（0.18+0.02 g/hm2）、蛇床子素+四霉素（0.20+0.20 g/hm2）、蛇床子素+申嗪霉素（0.90+0.10 g/hm2）以及清水对照共8个处理，每个处理小区面积为30 m2，设置3 次重复，随机区组排列。采用3WBJ-16DZ 多功能静电喷雾器喷药，全株均匀喷雾。药后30 d 进行调查，调查方法根据中华人民共和国国家标准GB/T 17980.19—2000《农药田间药效试验准则》的规定进行，以株为单位，根据铁皮石斛叶片和茎的危害症状程度进行分级，各小区采用五点取样法进行调查，每点调查10 株，并记录总株数、病株数和病级数。按照公式（6）和（7）计算病情指数和田间防治效果。

1.2.5 数据处理与分析 采用Excel 2010进行数据统计分析以及表格绘制。

2 结果与分析

2.1 7种生物药剂对铁皮石斛层出镰刀菌的生物活性分析

7 种生物药剂对铁皮石斛层出镰刀菌菌丝生长具有一定的抑制效果（表1）。其中，抑制效果较好的为丁子香酚、四霉素和申嗪霉素，其EC50值分别为0.38、0.32、1.85 μg/mL；蛇床子素、中生菌素次之，其EC50值分别为4.92、8.13 μg/mL；再次为大黄素甲醚，其EC50值为43.20 μg/mL；而春雷霉素对层出镰刀菌菌丝生长的抑制效果较弱，其EC50值达240.03 μg/mL。

表1 7种生物药剂对层出镰刀菌的生物活性Tab.1 Biological activity of seven biopesticides against Fusarium proliferatum

2.2 生物药剂组合对铁皮石斛层出镰刀菌的协同作用

生物药剂组合对铁皮石斛层出镰刀菌的协同作用结果如表2 所示，丁子香酚、蛇床子素、申嗪霉素以及四霉素4 个单剂和25 个生物药剂组合对铁皮石斛软腐病致病菌（层出镰刀菌）均有较好的抑制作用。丁子香酚+蛇床子素、蛇床子素+申嗪霉素、蛇床子素+四霉素、四霉素+申嗪霉素4个组合以有效质量比分别为1∶9、3∶1、1∶9、1∶3 时，其CTC 值均小于80，表现为拮抗作用。其余组合表现为相加作用或增效作用。其中，丁子香酚+蛇床子素、蛇床子素+申嗪霉素和蛇床子素+四霉素3个组合分别以有效质量比为9∶1、1∶1 和9∶1 时增效显著，其CTC值分别为325.38、236.46 和541.53，EC50值分别为2.86、1.23 μg/mL和0.75 μg/mL。

表2 丁子香酚、蛇床子素、四霉素和申嗪霉素组合对层出镰刀菌的协同作用Tab.2 Synergistic effects of eugenol，osthole，tetramycin and shenqinmycin against Fusarium proliferatum

2.3 增效组合对铁皮石斛软腐病的防治效果

2.3.1 室内防效 丁子香酚、蛇床子素、四霉素和申嗪霉素4个单剂以及丁子香酚+蛇床子素、蛇床子素+申嗪霉素、蛇床子素+四霉素均对铁皮石斛软腐病有一定的预防作用和治疗作用（表3 和表4）。其中，丁子香酚+蛇床子素（9∶1）对铁皮石斛软腐病具有较好的预防作用，3、7、14 d 的防效分别为100%、80.00%、77.78%，均高于单剂和其他组合；且其治疗作用也较好，14 d时，其防效高达90.91%。

表3 增效组合对铁皮石斛软腐病的预防作用Tab.3 Preventive effect of synergistic combinations on soft rot of Dendrobium officinale

表4 增效组合对铁皮石斛软腐病的治疗作用Tab.4 Therapeutic effect of synergistic combinations on soft rot of Dendrobium officinale

2.3.2 田间防效 增效组合对铁皮石斛软腐病的田间防效如表5所示。丁子香酚、蛇床子素、四霉素和申嗪霉素4个单剂以及丁子香酚+蛇床子素、蛇床子素+申嗪霉素、蛇床子素+四霉素对铁皮石斛软腐病的田间防效均高于55.36%。其中，增效组合对铁皮石斛软腐病的田间防效均优于单剂，且当丁子香酚+蛇床子素以有效质量比为9∶1时，对铁皮石斛软腐病的田间防效最好，高达69.46%。

表5 增效组合对铁皮石斛软腐病的田间防效Tab.5 Control effects of synergistic combinations on soft rot of Dendrobium officinale in field

3 结论与讨论

铁皮石斛作为一种珍贵的中药材，具有重要的药用价值和经济价值。野生铁皮石斛不能满足人们的需要，因此，人工种植铁皮石斛成为铁皮石斛的主要来源。但随着铁皮石斛人工种植规模的扩大，病害的发生也越来越严重，其中终极腐霉、细菌类欧式杆菌和层出镰刀菌等病原菌引起的软腐病是铁皮石斛上的重要病害，严重影响铁皮石斛的产量和质量。

本研究明确了丁子香酚、蛇床子素和四霉素等7种生物药剂对层出镰刀菌的毒力，其中丁子香酚、蛇床子素、四霉素、申嗪霉素抑制效果较好，其EC50值分别为0.38、4.92、0.32、1.85 μg/mL，与前人研究结果有一定的差异。如奉代力[22]测定的丁子香酚对灰葡萄镰刀菌的EC50值为1.43 μg/mL，而张洁等[23]测定申嗪霉素对假禾谷镰刀菌的EC50值为0.64 μg/mL，这可能是因为不同作物上分离所得的镰刀菌对丁子香酚和申嗪霉素的敏感性存在一定差异。

协同作用结果表明，不同配比的生物药剂组合对层出镰刀菌菌丝生长的抑制作用具有一定差异。其中，丁子香酚+蛇床子素、蛇床子素+申嗪霉素、蛇床子素+四霉素分别以有效质量比为9∶1、1∶1、9∶1时，对铁皮石斛层出镰刀菌的增效作用显著，而且室内盆栽试验表明，3 个组合对铁皮石斛软腐病具有一定的防治效果。其中，预防作用和治疗作用最好的是丁子香酚+蛇床子素（9∶1），其防效分别为77.78%和90.91%。丁子香酚+蛇床子素、蛇床子素+申嗪霉素、蛇床子素+四霉素分别以有效质量比为9∶1、1∶1、9∶1 时，田 间 防 效 分 别 为69.46%、67.74%、67.18%，可有效防治田间铁皮石斛软腐病的危害。本研究结果为田间铁皮石斛软腐病的防治提供参考的生物药剂选择，也为减少或替代化学农药用量，而提高铁皮石斛产量和质量提供了参考。