茶多酚对铅胁迫下烟草生理指标及铅积累的影响

张留双，谢 徽，2，杨金清，韩佳祺，保志娟

（1.云南农业大学 烟草学院，云南 昆明 650201；2.红云红河集团 红河卷烟厂，云南 弥勒 652399）

随着工农业生产发展、矿产开发利用和化肥等不合理使用，土壤中的重金属含量增加。2014 年《全国土壤污染状况调查公报》显示我国耕地污染点位超标率达19.4%，铅点位超标率1.5%。已经发现的40 多种土壤重金属元素中，铅（Lead，Pb）在环境中具有持久性且易被植物吸收，被认为是一种重要的重金属污染物[1-2]。云南省是典型的重金属地质高背景区，铅的储量和开发度居全国前列[3]，烟草栽培不可避免地面临铅胁迫问题。铅胁迫会破坏植物的氧化还原平衡，使植株氮素合成及分解受到抑制，光合能力下降，严重时干扰其他营养物质的吸收转运，甚至造成植株死亡[4-6]。茶多酚（Tea polyphenols，TP），又叫茶单宁或茶鞣质，是从茶叶中提取的一类多羟基酚类衍生物的混合物，具有良好的抗氧化、调节植物光合以及络合重金属的能力[7-8]。研究表明，茶多酚能增强干旱胁迫下黄瓜幼苗中谷氨酰胺合成酶、硝酸还原酶等代谢酶的活性，提高可溶性糖和蛋白质的含量，对切花月季的瓶插寿命及月季体内抗氧化酶活性也有不同影响[9-10]。杨颖丽等[11]和司廉邦等[12]发现，茶多酚能有效缓解盐胁迫对小麦幼苗的损伤，提高麦苗光合能力。茶多酚还可以减少铅胁迫下茶树的铅积累量，修复铬胁迫造成的玉米细胞损伤，有效缓解葡萄遭受酸铝毒害等[13-15]。近年来大量研究证实，外源茶多酚在调节植物抵御逆境胁迫方面起着积极作用，但茶多酚缓解烟草Pb 胁迫的研究鲜见报道。鉴于此，在前期预试验的基础上，采用盆栽试验方法，研究外源茶多酚对铅胁迫下烟叶抗氧化、氮代谢关键指标及烟株生物量和根茎叶中铅积累的影响，旨在探讨茶多酚的农业应用，为解决农业实践中的重金属铅胁迫问题提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试烟草品种为K326。供试土壤采自云南农业大学烟草学院试验大棚周边土地的红壤，其pH值5.84，有机质含量18.25 g/kg，全氮含量0.26 g/kg，全磷含量0.18 g/kg，全钾含量54.31 g/kg，碱解氮、速效磷、速效钾含量分别为7.23、4.22、97.34 mg/kg，铅含量为21.62 mg/kg，明显低于GB 15618—2018《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准》规定的土 壤Pb 污 染 风 险 筛 选 值[100 mg/kg（5.5＜pH 值≤6.5）]。花盆规格32 cm×19 cm×23 cm（上口直径×下底直径×高）。茶多酚用70%乙醇作为溶剂从云南产普洱茶的茶渣中提取，参照GB/T 8318—2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》测得茶多酚的含量。

1.2 试验设计

试验于2020 年5—10 月在云南农业大学烟草学院试验大棚进行，根据预试验确定对烟株产生中度胁迫的土壤Pb 添加量为750 mg/kg。试验共设置5 个 处 理：CK（正 常 条 件）、Pb（单 一Pb 处 理）、300TP+（Pb+300 mg/kg TP）、600TP+（Pb+600 mg/kg TP）、900TP+（Pb+900 mg/kg TP）。每个处理重复5盆。

烟苗采用漂浮育苗方式培育，成苗后移栽入花盆（盆底均置托碟）。每盆装风干土10 kg，植烟1株。移栽时一次性施用烟草专用复合肥[m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=12∶12∶24] 45 g。于移栽后14 d施入中性醋酸铅（配制成水溶液），次日，根据不同试验处理设置浇施茶多酚水溶液，后期进行常规管理。

1.3 测定指标与方法

移栽后60 d，用打孔器取6～9 叶位（从下往上数）鲜烟叶于液氮中保存，用于抗氧化和氮代谢相关指标的测定。移栽后80 d，将烟株按根、茎、叶分部位收获并测生物量，后依次用自来水、0.01 mol/L EDTA 溶液和去离子水清洗，于烘箱中105 ℃杀青30 min，60 ℃烘干，粉碎，过孔径0.425 mm 筛，用于烟株各部位铅含量的测定；同时，收集盆栽土壤风干过筛，用于土壤中铅含量的测定。

超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）含量测定参考王学奎等[16]的方法，硝酸还原酶（NR）活性测定参照邹奇[17]的方法，活性氧（ROS）和亚硝酸还原酶（NiR）活性采用苏州格瑞思生物科技公司的试剂盒测定，硝态氮（NO3--N）含量测定采用水杨酸法[18]，可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法。烟株铅含量测定参照《烟草及烟草制品铬、镍、砷、硒、镉、铅的测定电感耦合等离子体质谱法》（YC/T 380—2010）。

烟株Pb积累量=烟株生物量×烟株Pb含量。

1.4 统计分析

试验数据用Excel 2016 进行统计和Origin 2018作图，用SPSS 20.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 茶多酚对Pb胁迫下烤烟生物量的影响

由表1 可知，单一Pb 处理的烟株各部位生物量均显著低于CK，根、茎、叶及全株的生物量分别比CK减少21.2%、13.3%、36.2%、25.1%；添加茶多酚后烟株的根、茎、叶及全株生物量均比单一Pb 处理增高，以添加900 mg/kg 茶多酚处理增幅最大，根、茎、叶、全株的生物量分别比单一Pb 处理增加11.8%、6.8%、33.0%、17.5%。

表1 茶多酚对Pb胁迫下烤烟生物量的影响Tab.1 Effects of tea polyphenols on biomass of flue-cured tobacco under Pb stress

2.2 茶多酚对Pb胁迫下烟叶抗氧化系统的影响

2.2.1 抗氧化酶活性 由图1 可看出，单一Pb 处理的烟叶SOD、POD 活性均高于CK，分别高5.6%、30.3%；而CAT 活性下降5.2%。随茶多酚用量增加，烟叶SOD、POD 活性总体降低，而CAT 活性呈上升趋势。300、600、900 mg/kg 茶多酚处理的烟叶SOD 和POD 活性分别比单一Pb 处理降低2.6%、5.2%、3.5%和3.2%、17.1%、48.6%，CAT 活性升高13.6%、15.3%、20.8%。

图1 茶多酚对Pb胁迫下烟叶SOD、POD、CAT活性的影响Fig.1 Effects of tea polyphenols on activities of SOD，POD and CAT in tobacco leaves under Pb stress

2.2.2 MDA、ROS、H2O2含量 由图2 可看出，单一Pb 处理的烟叶MDA、ROS、H2O2含量均高于CK，分别增加了21.0%、7.4%、16.5%。添加茶多酚后，烟叶MDA 含量随茶多酚用量增加呈逐渐降低趋势，300、600、900 mg/kg 茶多酚处理分别比Pb 处理降低了4.9%、5.4%、39.3%；ROS 含量随茶多酚用量增加而逐渐上升，H2O2含量呈先降后增趋势，且添加茶多酚处理ROS 和H2O2含量均显著低于单一Pb处理。

图2 茶多酚对Pb胁迫下烟叶MDA、ROS、H2O2含量的影响Fig.2 Effects of tea polyphenols on contents of MDA，ROS and H2O2 in tobacco leaves under Pb stress

2.3 茶多酚对Pb胁迫下烟叶氮代谢指标的影响

由图3 看出，单一Pb 处理的烟叶NR 活性显著低于CK，降低了37.1%，而NO3--N 含 量比CK 显 著增加24.6%；添加茶多酚后，烟叶NR 活性随茶多酚用量增加呈先升后降趋势，300、600、900 mg/kg茶多酚处理的NR 活性分别比单一Pb 处理升高149.1%、268.6%、110.9%，而NO3--N 含量呈先减后增趋势且均低于单一Pb处理。此外，Pb胁迫下NiR活性略有升高但无显著变化，施加茶多酚后NiR 活性随茶多酚用量增加呈先减后增的趋势。烟叶可溶性蛋白含量在Pb 胁迫下比CK 显著升高39.78%，添加茶多酚后有所降低但不显著。

图3 茶多酚对Pb胁迫下烟叶NR、NiR活性和NO3-N、可溶性蛋白含量的影响Fig.3 Effects of tea polyphenols on activities of NR，NiR and contents of NO3-N and soluble protein in tobacco leaves under Pb stress

2.4 茶多酚对Pb胁迫下烟株Pb累积的影响

从表2 可知，Pb 胁迫处理使烟株根、茎、叶中Pb含量增至CK的16.9倍、7.6倍、3.7倍，各部位及全株的Pb 积累量亦均显著高于CK。添加茶多酚后，烟株根部Pb 含量显著降低，尤其是300 mg/kg 茶多酚处理根部Pb含量比单一Pb处理显著降低83.9%；茎中Pb含量随茶多酚用量增加呈先减后增趋势；叶中Pb 含量随茶多酚用量增加而逐渐降低。300、600、900 mg/kg 茶多酚处理的烤烟全株Pb 积累量均低于Pb 处理，分别降低65.8%、10.6%、8.6%。整体来看，烤烟对Pb 的吸收积累部位主要是根，其次是叶，最后是茎，但900 mg/kg 茶多酚处理时，Pb 在烟株中的含量和积累量表现为根＞茎＞叶。

表2 茶多酚对烟株Pb积累的影响Tab.2 Effects of tea polyphenols on Pb accumulation in tobacco

3 结论与讨论

3.1 茶多酚对Pb胁迫下烟叶抗氧化及氮代谢的影响

本试验中，在重金属Pb 处理下，烟叶膜脂过氧化产物MDA 和H2O2大量积累，ROS 含量上升，抗氧化酶SOD、POD活性增强，这与张浩等[19]研究的烤烟Pb 胁迫下抗氧化系统的变化规律一致。表明本试验设计的Pb 处理对烟叶造成了较严重的膜脂过氧化损伤，而CAT活性下降可能是由于其需与POD 共同作为第二线防御系统相互协调以维持烟叶代谢平衡所致[20-21]。添加茶多酚后，烟叶脂质过氧化物均有不同程度降低，SOD、POD 活性降低而CAT 活性随茶多酚用量增加而逐渐增高，可能是茶多酚利用其强还原性清除植物体内氧自由基，导致SOD 活性降低，同时诱导CAT 清除过量的H2O2，降低POD活性；但其具体的作用机制还有待进一步研究。

通常情况下，土壤中的氮被植物吸收后，硝态氮在硝酸还原酶作用下转化为亚硝态氮，再经亚硝酸还原酶作用转化为羟胺，后经各种转氨酶作用生成不同种类氨基酸进而合成蛋白质[22]。本试验中，Pb处理下的烟叶NR活性显著降低而NO3-N含量显著增加，NiR 活性升高，表明Pb 胁迫一定程度上抑制了烟叶硝态氮的转化，促进了亚硝态氮分解，这与李裕红等[23]、张艳英等[24]的研究结果类似。本试验亦表明，Pb 胁迫下烟叶可溶性蛋白含量会增加，可能是由于可溶性蛋白作为一种渗透调节物质使细胞保持适当的渗透势而防止脱水[25]，同时对生物分子的结构和功能起到稳定和保护作用[26]；此外，值得注意的是，烟叶可溶性蛋白含量过高在燃吸时会引起辛辣、呛刺等[27]，因此推测Pb 处理下烟叶可溶性蛋白含量增加可能是影响烟叶品质的不利因素。浇施茶多酚后，提升NR 活性促进NO3-N 转化，说明茶多酚在一定程度上促进了氮代谢；而可溶性蛋白含量呈不同程度降低，说明茶多酚减弱了Pb对烟叶的渗透胁迫。

3.2 茶多酚对Pb胁迫下烟株生物量和Pb积累的影响

Pb 胁迫下，烤烟生长受到抑制，烟株生物量降低。而添加茶多酚后，烟株根部、叶部及全株生物量均高于Pb 处理，这说明茶多酚缓解了Pb 胁迫对烟草生长的抑制。

通常烟草根部对Pb有较强的吸收和富集能力，是叶部和茎部的2～5 倍，而叶的吸收富集能力一般大于茎[28]。本试验结果表明，各部位Pb 积累均为根＞叶＞茎，与前人的研究基本一致。但当茶多酚添加量达900 mg/kg 时，烟茎中积累的Pb 含量却高于叶。本试验中，添加茶多酚后根系Pb含量和积累量均显著降低，这可能是茶多酚络合了土壤中的部分Pb，将其转化为不易被烟草根系吸收的络合态化合物，使根部Pb积累降低。茶多酚也可能同时调控了烟株对Pb 和其他营养物质的吸收转运，部分Pb 随营养元素一起被转运到地上部，造成个别处理烟叶、烟茎部位Pb含量的增加。

该试验设计的Pb 胁迫浓度对烟草产生明显毒害。施加外源茶多酚能使Pb 胁迫下烟株生物量增加，降低烟叶膜脂过氧化损伤，促进烟叶硝态氮转运分解，减少烟株体内Pb 含量，尤其是根部Pb 积累，进而在一定程度上缓解烟草Pb胁迫。