氮肥及有机物料配施对黄壤冬油菜-玉米轮作田土壤微生物群落的影响

魏全全，顾小凤，芶久兰，张 萌，饶 勇，肖华贵

（1.贵州省农业科学院 土壤肥料研究所，贵州 贵阳 550006；2.贵州省农业科学院 油料研究所，贵州 贵阳 550006）

有机肥替代部分化肥是保障国家粮食安全、生态环境安全和资源高效利用的重要措施，对提高土壤质量、减少化肥施用、改善生态环境具有十分重要的现实意义[1]。有机肥替代化肥可改善土壤质量，改变真菌、细菌群落结构及多样性[2-5]，使细菌数量有所增加[6]、真菌群落结构更加稳定[7-8]。马龙[9]在不同施肥模式对设施菜田土壤微生物群落结构及氮循环影响的研究中发现，有机肥/秸秆替代化肥土壤细菌、真菌多样性及丰富度指数均处于较高水平。

冬油菜-玉米轮作是贵州旱地农业主要的种植模式[10]，可降低和减缓病虫害的发生[11]。轮作模式下有机肥替代对土壤微生物的影响也有较多研究，张慧等[12]发现，在稻-菜轮作下氮肥配施有机肥处理细菌群落Chaol 指数、Shannon 指数、Simpson 指数高于不施用氮肥处理，真菌Chaol 指数高于不施用氮肥处理，真菌Shannon 指数、Simpson 指数均低于不施用氮肥处理；细菌的变形菌门（Proteobacteria）和真菌的子囊菌门(Ascomycota)相对丰度最高。在小麦-甘薯轮作系统中，50%化肥与50%生物有机肥配施能够显著提高土壤不同结合态腐殖质含量及组分含量，明显改善土壤微生物群落构成[13]。烤烟-玉米轮作中施用有机肥的土壤可培养微生物（细菌、真菌、放线菌）数量增多，种群多样性增加，改善了土壤生态环境[14]。叶盛嘉等[15]的研究表明，减氮配施有机肥显著影响土壤细菌群落β 多样性，门水平上，显著降低放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度；属水平上，显著增加unclassified Gp6、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）平均相对丰度，降低诺卡氏菌（Nocardioides）、克里布所菌（Kribbella）、列舍瓦列 氏 菌（Lechevalieria）、原 小 单 孢 菌（Promicromonospora）、马赛菌（Massilia）、糖霉菌（Glycomyces）、Dongia的平均相对丰度。目前，有大量关于轮作模式下有机肥替代化肥对土壤微生物影响的研究，但关于黄壤旱地冬油菜-玉米轮作中氮肥配施有机肥对土壤微生物群落影响的研究尚未见报道。因此，拟基于贵州黄壤，设置冬油菜-玉米轮作定位试验，探究氮肥与有机肥配施对冬油菜-玉米轮作田土壤微生物群落结构的影响，为贵州黄壤地力改善以及冬油菜和玉米丰产提质提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验地点与材料

试验于2018—2021 年在贵州省农业科学院土壤肥料研究所试验基地（26°30′10″E、106°39′26″N）实施。该地属亚热带湿润温和型气候，平均气温15.3 ℃，平均降雨量1 000～1 100 mm。试验地土壤为黄壤，基本理化性状：pH值5.39、全氮1.58 g/kg、有机质25.15 g/kg、速效磷20.53 mg/kg、速效钾111.69 mg/kg、有效硼0.83 mg/kg。

供试冬油菜品种为黔油1588，玉米品种为盛农3 号。供试化学肥料为市售尿素（N 46%）、过磷酸钙（P2O512%）、硫酸钾（K2O 50%），供试有机物料为玉 米 秸 秆（全 氮0.940%、全 磷0.048%、全 钾1.278%）、水稻生物炭（全氮0.659%、全磷0.268%、全钾2.907%，由辽宁金和福农业科技股份有限公司提供）、商品有机肥（全氮1.653%、全磷0.846%、全钾0.443%，由贵州地宝生物科技有限公司提供）。

1.2 试验设计

试验共设置5 个处理：不施氮肥+磷钾肥（T1，CK）；氮肥+磷钾肥（T2）；氮肥+磷钾肥+秸秆（T3）；氮肥+磷钾肥+生物炭（T4）；氮肥+磷钾肥+商品有机肥（T5）。

小区面积为20 m2（长10 m×宽2 m），3 次重复，随机区组排列。除T1 不施用氮肥外，各处理氮肥（N）、磷肥（P2O5）、钾肥（K2O）用量一致。冬油菜季生长期为当年9 月至翌年5 月，氮（N）、磷（P2O5）、钾（K2O）用量分别为180、90、120 kg/hm2，其中氮肥按基肥∶越冬期肥∶抽薹期肥=6∶2∶2 分3 次施用，过磷酸钙、硫酸钾作基肥一次施入；玉米季生长期为每年5—8 月，氮（N）、磷（P2O5）、钾（K2O）用量分别为150、120、150 kg/hm2，其中氮肥按基肥∶拔节期肥∶抽穗期肥=4∶2∶4 分3 次施用，过磷酸钙、硫酸钾作基肥一次施入。商品有机肥、生物炭、秸秆还田量均为3 000 kg/hm2，在作物移栽前翻耕至土壤中；在化学肥料撒施翻入土壤后移栽冬油菜和玉米。冬油菜移栽密度为105 000 株/hm2，玉米移栽密度为52 500 株/hm2。其他田间生产管理均采用农业技术推广部门的推荐技术。

1.3 测定项目与方法

于2021年5月冬油菜收获后，对每个小区取0～20 cm 土壤样品，称取相当于0.5 g 干土质量的新鲜土 壤 ，采 用 FastDNA®SPIN Kit for Soil（MPBiomedicals，上海）试剂盒提取土壤微生物总DNA，采用1%的琼脂糖电泳检测DNA 样品是否有降解以及杂质，采用Nanodrop 2000分光光度计检测样品纯度。经DNA 浓度和纯度检测（DNA 质量浓度≥20 ng/μL，总量≥500 ng，D260/280为1.8～2.0）后，利用美国ABI GeneAmp®9700 型PCR 仪对细菌16S rRNA 基因进行PCR 扩增，扩增引物为338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′ ）和806 R（5′-GGACTAHVGGGTWTCTAAT-3′）。对真菌ITS进行PCR 扩增，扩增引物为ITS1F（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。

PCR 反 应 体 系：5×TransStart FastPfu 缓 冲 液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下 游 引 物（5 μmol/L）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA 聚 合 酶0.4 μL，模 板DNA 10 ng，以ddH2O 补足至20 μL。每个样本3 个重复，获得扩增产物后，进一步通过2.0%琼脂凝胶电泳检测PCR产物纯化效果，测定纯化后PCR 产物的浓度，将土壤样品16S rRNA、ITS 基因的PCR 纯化产物等摩尔系数混合，利用Thermo Scientific 公司的GeneJET 胶回收试剂盒回收目标条带，委托上海美吉生物医药科技有限公司完成测序。

1.4 数据处理与分析

采用Mothur 软件进行多样性指数（Chaol、Shannon、Simpson 指数）计算；采用Origin 8.0 软件进行作图；采用SPSS 20.0 软件进行方差分析；采用LSD法检验P＜0.05 水平上的差异显著性；采用上海美吉生信云平台进行线性判别分析（Linear discriminant analysis effect size，LEfSe）。

2 结果与分析

2.1 氮肥及有机物料配施对冬油菜-玉米轮作田土壤微生物群落组成的影响

由图1A 可知，共得到4 300 个土壤细菌操作分类单元（Operation taxonomic units，OTU），其中T1（CK）、T2、T3、T4、T5 处理的OTU 数量分别为3 557、3 413、3 315、3 452、3 468 个。5 个处理的共同OTU数量为2 339 个，分别占T1、T2、T3、T4、T5 处理总OTU 数 量 的65.76%、68.53%、70.56%、67.76%、67.45%。T1、T2、T3、T4、T5 处理各自特有的OTU 数量分别为75、32、45、35、70 个，占相应处理总OTU数量的2.11%、0.94%、1.36%、1.01%、2.02%。

图1 氮肥及有机物料配施下冬油菜-玉米轮作田土壤中细菌（A）和真菌（B）OTU数量Fig.1 Bacterial（A）and fungal（B）OTU number in soil under nitrogen fertilizer combined with organic materials in winter rapeseed-maize rotation

由图1B 可知，共得到2 500 个土壤真菌OTU，其 中T1、T2、T3、T4、T5 处 理 的OTU 数 量 分 别 为1 530、1 196、1 488、1 428、1 579 个。5 个处理的共同OTU 数量为655 个，分别占T1、T2、T3、T4、T5 处理总OTU 数量的42.81%、54.77%、44.02%、45.87%、41.48%。T1、T2、T3、T4、T5 处理各自特有的OTU 数量分别为181、58、159、135、187 个，占相应处理总OTU数量的11.83%、4.85%、10.69%、9.45%、11.84%。

2.2 氮肥及有机物料配施对冬油菜-玉米轮作田土壤微生物多样性指数的影响

由表1 可知，氮肥及有机物料配施改变了土壤细菌群落多样性指数。与T1处理相比，氮肥及有机物料配施提高了Chaol 指数、Shannon 指数，增幅分别为0.67%～7.79%、0.30%～1.36%，其中T3 处理的Chaol 指数、Shannon 指数均最大，分别为3 374.05、6.72，显著高于T1 处理，但与其他处理差异不显著。氮肥及有机物料配施降低了Simpson 指数，降幅为2.94%～11.76%，T3处理降幅最大。

表1 氮肥及有机物料配施下冬油菜-玉米轮作田土壤细菌群落多样性指数Tab.1 Diversity index of soil bacterial communities under nitrogen fertilizer combined with organic materials in winter rapeseed-maize rotation

由表2 可知，氮肥及有机物料配施改变了土壤真菌群落多样性指数。与T1处理相比，氮肥及有机物料配施提高了Chaol 指数、Shannon 指数，增幅分别为9.64%～20.66%、29.55%～61.86%，其中T5 处理的Chaol 指数、Shannon 指数均最大，分别为1 102.86、4.71。氮肥及有机物料配施降低了Simpson 指数，降幅为55.83%～89.52%，各氮肥及有机物料配施处理均显著低于T1 处理，其中T5 处理最小，为0.027 3。

表2 氮肥及有机物料配施下冬油菜-玉米轮作田土壤真菌群落多样性指数Tab.2 Diversity index of soil fungal communities under nitrogen fertilizer combined with organic materials in winter rapeseed-maize rotation

2.3 氮肥及有机物料配施对冬油菜-玉米轮作田土壤微生物群落丰度的影响

2.3.1 氮肥及有机物料配施对冬油菜-玉米轮作田土壤微生物门水平群落结构的影响 通过对不同处理的土壤细菌群落组成进行分析发现，在门水平上共检测出20 个细菌种类和未确定类群，其中T1—T5 处理的变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度较高，分别为27.57%～34.20%、12.18%～15.72%、19.72%～22.11%、11.94%～20.87%、7.44%～8.72%（图2A）。进一步分析发现，施肥及有机物料配施改变了土壤中细菌优势菌种的相对丰度。与T1处理相比，T2—T5 处理Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria的相对丰度分别提高了1.74%～24.05%、9.03%～29.06%、2.13%～12.12%，其 中 T4 处 理 的Proteobacteria、Actinobacteria 提升幅度最大，T3处理的Chloroflexi 提升幅度最大；Acidobacteria、Bacteroidetes 的相对丰度有所下降，下降幅度为17.78%～42.79%、12.61%～14.68%，其中T4 处理的Acidobacteria 下降幅度最大，T3处理的Bacteroidetes下降幅度最大。

图2 氮肥及有机物料配施下冬油菜-玉米轮作田土壤中细菌（A）和真菌（B）门水平主要群落相对丰度Fig.2 Relative abundance of major community at the level of bacterial（A）and fungal（B）phylum in soil under nitrogen fertilizer combined with organic materials in winter rapeseed-maize rotation

通过对不同施肥条件下土壤真菌群落组成进行分析发现，在门水平上共检测出11个真菌种类和未确定类群，其中T1—T5 处理的子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）、Unclassified_k_Fungi、罗兹菌门（Rozellomycota）的相对丰度较高，分别为39.55%～68.00%、12.64%～44.14%、3.91%～8.66%、1.09%～3.63%、0.54%～2.63%（图2B）。进一步分析发现，氮肥及有机物料配施改变了土壤中真菌优势菌种的相对丰度。与T1 处理相比，T2—T5 处理的Ascomycota、Mortierellomycota、Unclassified_k__Fungi、Rozellomycota 的相对丰度均下降，下降幅度分别为2.79%～41.84%、33.14%～54.85%、4.13%～69.97%、37.64%～79.47%，均以T5 处理下降幅度最大；Basidiomycota 的相对丰度有所提升，提升幅度为29.78%～249.21%，以T5处理的提升幅度最大。

2.3.2 氮肥及有机物料配施对冬油菜-玉米轮作田土壤微生物属水平群落结构的影响 通过对不同处理土壤细菌群落组成进行分析发现，在属水平上共检测出378 个细菌种类和未确定类群，其中T1—T5 处 理 的 Norank_c_Subgroup_6、Norank_f_Roseiflexaceae、Norank_o_Saccharimonadales、Norank_f_Gemmatimonadaceae、Norank_f_A4b的 相 对 丰 度 较高，分别为6.39%～14.46%、3.23%～4.23%、1.52%～4.09%、2.12%～2.40%、1.45%～2.60%（图3A）。进一步分析发现，与T1 处理相比，氮肥及有机物料配施提 高 了 Norank_f_Roseiflexaceae、Norank_o_Saccharimonadales、Norank_f_A4b的相对丰度，增幅分别为17.34%～30.96%、113.16%～169.08%、2.76%～79.31%，其 中T3 处 理 的Norank_f_Roseiflexaceae、Norank_f_A4b提升幅度最大，T5 处理的Norank_o_Saccharimonadales提升幅度最大。氮肥及有机物料配 施 使 Norank_c_Subgroup_6、Norank_f_Gemmatimonadaceae的相对丰度分别下降了24.48%～55.81%、0.83%～11.67%，其 中T4 处 理 的Norank_c_Subgroup_6下降幅度最大，T3 处理的Norank_f_Gemmatimonadaceae下降幅度最大。

图3 氮肥及有机物料配施下下冬油菜-玉米轮作田土壤中细菌（A）和真菌（B）属水平主要群落相对丰度Fig.3 Relative abundance of major commumity at bacterial（A）and fungal（B）genus levels in soil under nitrogen fertilizer combined with organic materials in winter rapeseed-maize rotation

通过对不同处理土壤真菌群落组成进行分析发现，在属水平上共检测出598 个真菌种类和未确定类群，其中T1—T5 处理的镰刀菌属（Fusarium）、被 孢 霉 属（Mortierella）、Unclassified_k_Fungi、Unclassified_p_Ascomycota、木霉属（Trichoderma）的相对丰度较高，分别为6.17%～13.95%、3.11%～6.47%、1.09%～4.47%、0.88%～1.91%、0.51%～1.73%（图3B）。进一步分析发现，氮肥及有机物料配施均降低了土壤中真菌优势菌种的相对丰度。与T1 处理相比，Fusarium、Mortierella、Unclassified_k_Fungi、Unclassified_p_Ascomycota、Trichoderma相对丰度分别下降4.95%～55.77%、35.24%～51.93%、18.79%～75.62%、8.38%～53.93%、2.89%～70.52%。

2.4 氮肥及有机物料配施对冬油菜-玉米轮作田土壤微生物群落结构影响的LEfSe分析

对不同处理土壤细菌和真菌群落进行LEfSe 分析发现，各处理土壤中具有重要作用的细菌（图4A）各不相同，具体表现：T1 处理为Norank_f_Chitinophagaceae，T2 处理为肠杆菌属（Enterobacter），T3 处 理 为Norank_o_Saccharimonadales，T4 处 理 为链霉菌属（Streptomycetales），T5 处理为罗丹杆菌属（Rhodanobacteraceae）。土壤中具有重要作用的真菌类群（图4B）也各不同，具体表现：T1 处理为类壳菌属（Sordariomycetes），T2 处理为担孢酵母菌属（Papiliotrema），T3 处理为伞菌属（Agaricomycetes），T4 处 理 为Unclassified_o_Onygenales，T5 处 理 为Ascomycota。

图4 氮肥及有机物料配施下冬油菜-玉米轮作田土壤细菌（A）和真菌（B）群落LEfSe分析Fig.4 LEfSe analysis of soil bacterial（A）and fungal（B）communities under nitrogen fertilizer combined with organic materials in winter rapeseed-maize rotation

3 结论与讨论

土壤微生物是农田生态系统的重要组成部分，同时也是反映土壤健康质量及肥力质量的重要指标[16]。轮作体系中，土壤微生物多样性受施氮水平的持续性影响，施氮水平能够直接影响微生物种群异步性，从而影响微生物功能的互补性[17]。Chaol指数用于估计群落样本中的OTU 数量，Shannon 指数、Simpson 指数用于评价群落多样性与均匀度。在本研究中，与不施氮肥T1 处理相比，氮肥及有机物料配施提高了土壤细菌中Chaol 指数、Shannon 指数，其中T3 处理的Chaol 指数和Shannon 指数增幅均最大。氮肥及有机物料配施降低了Simpson 指数，其中T3 处理的Simpson 指数降幅最大。氮肥及有机物料配施也同样提高了真菌中Chaol 指数、Shannon指数，其中T5 处理的Chaol 指数、Shannon 指数增幅均最大。氮肥及有机物料配施降低了真菌的Simpson 指数，其中T5 处理的Simpson 指数降幅最大。说明合理进行有机物料配施有助于提高土壤细菌和真菌群落多样性与丰富度，这与胡岚[3]的研究结果一致。

前人研究表明，有机肥长期替代部分化肥对土壤中不同微生物群体的结构和丰度影响不同[18]。同等养分投入量下，有机物料配施可提高土壤细菌和真菌丰度，改变土壤优势菌群的组成，增加微生物多样性[19]。生物有机肥替代相比长期单施化肥对土壤致病菌——镰刀菌和大丽轮枝菌有明显抑制作用[20]。本研究中，氮肥及有机物料配施处理提高了土 壤 细 菌Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria的相对丰度，降低了土壤细菌Acidobacteria、Bacteroidetes 的相对丰度。氮肥及有机物料配施提高了土壤真菌Basidiomycota 的相对丰度，降低了土壤 真 菌 中 Ascomycota、Mortierellomycota、Unclassified_k_Fungi、Rozellomycota 的 相 对 丰 度。这与吴宪等[7]的研究结果一致，说明在氮肥及有机物 料 配 施 中 ，Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria 菌群在土壤细菌分子生态网络中起重要的连接作用。同时，Proteobacteria 等作为富营养细菌，在有机物料配施后丰度增加，说明有机物料配施后土壤养分增加。Basidiomycota真菌可以快速代谢沉积在植物根际的有机质，加速土壤碳循环[21]。本研究中，有机物料配施后使得Basidiomycota 的丰度增加，这与苏港[22]的研究结果一致，进一步说明氮肥配施有机物料处理可改善土壤中有益真菌菌群的丰度。同时，本研究结果表明，氮肥及有机物料配施处理土壤真菌中Fusarium的相对丰度最多可下降55.77%，说明氮肥配施有机物料可降低或抑制真菌中某些致病菌的生长。

综上，在冬油菜-玉米轮作系统下进行氮肥及有机物料配施，土壤细菌、真菌群落结构以及多样性有所变化，Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Basidiomycota 等有益微生物的相对丰度增加，致病菌Fusarium相对丰度减少。在冬油菜-玉米轮作系统中进行氮肥及有机物料配施，在一定程度上有提升土壤有益菌群数量、降低或抑制有害菌群数量的作用，从而改善土壤微生态环境，有助于冬油菜-玉米轮作田黄壤地力改善、可持续循环发展。