北柴胡内生真菌分离鉴定及其生防促生活性分析

杜衎，高德民，孙燕，冯筱涵，曹海禄，张颖颖

(1. 山东中医药大学药学院， 山东济南 250355；2. 恒德本草(北京)农业科技有限公司，北京 100071；3. 山东中医药大学中医学院， 山东济南 250355)

内生真菌普遍存在于植物健康组织中，且显著影响植物中代谢产物的形成。 内生真菌作为生物肥料的重要来源，具有受外界环境影响小、对宿主防卫反应耐受度高等优点，探索植物和内生真菌之间的相互作用是推动农业可持续发展的一种有效策略[1－3]。 近10 年来，超过83 科212 种药用植物被分离出376 属以上的内生真菌，其中一些内生真菌已经被利用于植物栽培、生防菌研发、土壤生态修复等[4]。 植物内生真菌的生防和促生功能研究已成为一大热点，Chen 等[5]研究表明，内生真菌卷叶毛霉(Mucor circinelloidesDF20)可显著提高丹参酮生物合成途径中某些重要酶基因(DXS、DXR、HMGR、GPPS)的表达水平，促进根中丹参酮的生物合成和积累；Schmidt 等[6]发现混合接种内生真菌能显著促进芒草在重金属污染土壤上的生长；王海霞等[7]从燕麦中分离出的降解淀粉芽孢杆菌对炭疽病防治效果显著。

北柴胡(Bupleurum chinenseDC.)为《中国药典》规定的柴胡基源植物，具有抗癌、抗炎、抗菌等药理作用，是我国大宗药材和国家重点保护野生药材品种之一[8，9]。 随着新型冠状病毒肺炎防治的正常化和公共卫生要求的提高，北柴胡国内外市场需求量和种植面积迅速增加[10]。 根腐病、锈病严重影响北柴胡品质与产量[11]。 目前北柴胡病害的防治主要依靠化学方法，化学药剂的长期使用导致农药残留、环境污染等问题突出。 因此，利用北柴胡有益内生真菌发展北柴胡绿色、标准化栽培具有很大潜力[12]。 目前关于北柴胡内生真菌群落结构及功能菌株的研究未见报道，因此本试验以组织块分离法对北柴胡内生真菌进行分离并鉴定，初步分析北柴胡内生真菌多样性，并对内生菌株进行抑菌活性及促生活性测定，筛选出11 株优良菌株并进行ITS 分子鉴定，以期为进一步研究、开发与利用北柴胡内生菌资源用于生物防治与植物促生研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 北柴胡植株为一年生栽培品成熟期植株，生长地年均日照时数为2 446.6 h，年均气温14.4℃，年均降水量661.7 mm，土壤类型为棕壤土。 于2021 年8 月下旬采自山东中医药大学百草园(36°33′24.73″N，116°47′50.24″E)，并经山东省农业科学院生物技术中心鉴定为北柴胡。 新鲜植株用冰袋低温保存，在2 h 内进行内生菌分离试验。

1.1.2 培养基 PDA 培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、阿须贝氏(Ashby)培养基、沙氏液体培养基，参考周德庆和徐德强[12]的配制方法；无机磷、有机磷与解钾菌筛选培养基均参考孙玉[13]的方法配制；产葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶活性筛选培养基配制参考李雪艳等[14]的配方。

1.1.3 病原指示菌 大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)作为指示细菌，由山东中医药大学医学院微生物实验室张颖颖教授提供；层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌(Fusarium solain)作为指示真菌，由山东省农业科学院孙文研究员提供。

1.2 试验方法

1.2.1 内生真菌分离和纯化 参考柳靖婷[15]的方法，结合北柴胡组织特点，采用组织块分离法对北柴胡内生真菌进行分离。 主要消毒条件:75%乙醇浸泡(根、茎5 min，叶3 min)及5% NaClO 溶液浸泡(叶5 min，根、茎10 min)。

1.2.2 内生真菌鉴定 参考《真菌鉴定手册》[16]进行形态学鉴定。 将筛选的菌株纯化后，在无菌状态下挑取菌丝，置于研钵中用液氮充分研磨菌丝体至粉末状，采用DNA 提取试剂盒提取菌株DNA，采用引物ITS4－R(5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′)和ITS5－1737F(5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3′)扩增北柴胡内生真菌的5.8S rDNA－ITS 片段，扩增体系(50 μL):10×PCR buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，dNTPs(2 mmol/L)4 μL，正向和反向引物(5 μmol/L)各2 μL，Taq酶(2 U/μL) 1 μL，DNA 模板(10 ng/μL)2 μL，加ddH2O 至50 μL。 委托广东美格基因科技有限公司进行测序，在NCBI 网站的Genbank 数据库中进行序列比对，分析内生真菌多样性。 通过MEGA 7.0 软件中的邻接法(neighbor－joining methods， NJ)、基于Kimura 2－parameter 距离构建抑菌和促生活性菌株系统发育树，并以自展法(bootstrap)进行检测，自展次数设为1 000次[17]。

1.2.3 抑菌活性菌株筛选与测试 初筛选参考袁林等[18]的方法进行。 北柴胡内生真菌对细菌指示菌的抑菌活性测试采用琼脂块法，对真菌指示菌的抑菌活性测试采用平板对峙法。 参考赵龙飞等[19]的方法采用牛津杯法测定初期筛选的活性强的菌株的发酵培养物上清液抑制能力，菌株发酵上清液150 μL 注入牛津杯中，每平板放置3个无菌牛津杯，每菌株设置3 个重复。

活性菌株产真菌细胞壁降解酶能力测试:采用平板透明圈法[14]测试拮抗菌产胶体几丁质酶、蛋白酶、葡聚糖酶、纤维素酶能力，分别将待测菌株琼脂块放置4 种酶测试平板上，每处理4 个重复，以0.1%刚果红溶液浸渍培养基上表面20 min后冲洗，测量透明圈大小。

1.2.4 促生菌株筛选与测试 IAA 分泌能力菌株筛选:分泌植物生长素(IAA)能力测定所用PC 比色液和S2比色液的配制参考李振东等[20]的方法，北柴胡内生真菌分泌IAA 能力的定性测定采用Salkowski 比色法[21]。 PC 比色液显色则表明该菌液IAA 浓度为低浓度，S2比色液显色则为高浓度。采用标准品绘制两组IAA 标准曲线进行定量测试，第一组浓度梯度为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mg/L，第二组浓度梯度为25、50、75、100、125、150 mg/L。 各菌株菌液采用相应显色液显色，在OD530波长条件下使用紫外－可见光分光光度计测量吸光度，根据标准曲线最终确定其IAA分泌量。

溶磷菌株筛选参考王贵生[22]的方法。 在无机磷筛选平板、有机磷筛选平板分别接种各待测菌株，观察是否有溶磷透明圈产生，定性测试阳性菌株。 以钼锑抗比色法于无机磷筛选液体培养基和有机磷筛选液体培养基培养的发酵液中测定可溶性磷含量。 潜在固氮能力菌株筛选参考Viuar等[23]的方法，于阿须贝氏(Ashby)培养基固体平板接种各待测菌株，观察菌株是否生长及产生暗白色光晕，采用综合元素分析仪测定活性菌株于相应液体培养基发酵液中的可溶性氮含量[23]。解钾能力菌株筛选参考于发莲[24]的方法，将待测菌株接种于解钾固体培养基平板上，采用四苯硼酸钾重量法测定活性菌株于相应液体培养基发酵液中的可溶性钾含量。 产铁载体菌株筛选参考雷平等[25]的方法。

以上筛选试验均做4 个重复，定量试验待测菌株接种量为0.1 mL(105～106cfu/mL)，培养时间为5 d，以接种无菌PDA 培养基琼脂块为空白对照。

1.3 数据分析

抑菌率(%)＝(对照菌落生长直径－处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径×100；分离率(%)＝分离内生真菌数/组织块数×100；分离频率(%)＝样本中分离到的某种内生真菌数/分离到的总菌株数×100；多样性指数(H′)＝－ΣPi×lnPi，其中Pi是指特定部位某种真菌的菌株数占分离到真菌菌株总数的比值。

采用SPSS 17.0 对试验所得数据进行方差分析，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 内生真菌组织分布

从植株的345 个组织块中共分离得到270 株菌株，其中从根、茎、叶中分别分离到87、122、61株内生真菌，北柴胡内生真菌在茎中的分离率(84.14%)与多样性指数(1.31)最高(表1)。

表1 植株内生真菌分离结果

结合形态学和显微特征，270 株菌株共鉴定为17 属(表2)。 从根中共分离得到10 属，其中青霉属(Penicillium)与生赤壳属(Bionectria)为优势属，分离频率分别为9.26%和8.88%；茎中内生真菌共12 属，链格孢属(Alternaria)和曲霉属(Aspergillus)为优势属，分离频率分别为10.37%和10.00%，而根中并未分离得到这两属内生真菌。叶中共分离到8 属内生真菌，青霉属(Penicillium)和生赤壳属(Bionectria)为优势属，分离频率分别为8.88%和5.92%。 内生真菌与北柴胡组织器官长期共存，共同进化形成一种稳定的共生关系，内生真菌根、茎、叶分布具有明显的组织特异性与一定的相似性。

表2 根、茎、叶内生真菌属组成

2.2 抑菌活性菌株筛选

2.2.1 初筛选结果 结合北柴胡内生真菌形态与显微特征，挑选出差异较大的54 株代表性菌株进行活性筛选。 结果表明(表3)，北柴胡内生真菌具有抑菌活性的菌株比例较高，有46%的测试菌株对6 种指示菌中至少一种病原指示菌表现出抑菌活性，BCR－097、BCR－098、BCR－458、BCS－428、BCS－500、BCL－009、BCL－449、BCR－427、BCS－420、BCS－591 对5 种及5 种以上指示菌具有抑菌活性，抑菌谱较广，其中BCS－428 抑菌活性最高，对3 种细菌指示菌抑菌圈直径达到16 mm 以上，对两种真菌指示菌抑菌率达到70%以上。

表3 北柴胡内生真菌抑菌活性筛选结果

2.2.2 复筛选结果 对初筛试验中具有拮抗作用的菌株进行液体发酵并通过离心取上清液进行抑菌活性测试，结果表明(表4)，对金黄色葡萄球菌抑菌活性最强的为BCR－458，对大肠杆菌、铜绿假单胞菌及茄病镰刀菌抑菌活性最强的为BCS－428，对层生镰刀菌抑菌活性最强的为BCL－449，对尖孢镰刀菌抑菌活性最强的为BCR－097。

表4 内生真菌发酵液抑菌活性

2.2.3 产真菌细胞壁降解酶能力测试 对初筛具较高抑菌活性的菌株进行产真菌细胞壁降解酶能力测试，结果(表5)表明，BCR－097、BCR－098、BCR－458、BCS－420、BCS－500、BCL－009 能够产生4 种酶，BCR－098 产蛋白酶和几丁质酶能力最强，BCS－591 产葡聚糖酶能力最强，BCL－449 产纤维素酶能力最强。

表5 酶解透明圈外径(mm)

2.3 促生活性菌株筛选

2.3.1 内生真菌分泌IAA 能力定性与定量分析通过绘制IAA 标准曲线(图1)，得到IAA 分泌量测定公式为y ＝0.0393x－0.0051(R2＝0.9947)和y ＝0.0224x＋0.0960(R2＝0.9956)。 本试验结果表明(表6)，在54 株测试菌株中，具有分泌IAA 能力的菌株共有18 株，占总测试北柴胡内生菌株的33%，其中11 株合成IAA 为色氨酸途径，BCS－493 在没有添加色氨酸和添加色氨酸两种情况下都发生了颜色反应，证明其可通过两种途径合成IAA。 在所有测试菌株中BCS－591、BCS－500 IAA分泌量较高，分别为59.55 mg/L 和76.16 mg/L，具有较高的植物促生研究价值。

图1 IAA 分泌量测定标准曲线

表6 内生真菌IAA 分泌定性与定量筛选结果

2.3.2 内生真菌固氮、溶磷、解钾、产铁载体活性菌株筛选 在54 株待测菌株中，共12 株在解钾固体平板上产生黄色光晕。 对12 株解钾活性菌株进行定量测试，结果表明(图2A)，测试菌株BCR－513 与BCR－098 菌液所产可溶性钾含量最高，相比空白培养液，增量分别为26.76 mg/L 和20.90 mg/L。 在BCS－420 与BCS－467 菌液培养过程中，显微镜发现两菌株菌丝能有效吸附钾长石矿粉颗粒形成真菌－矿物聚集体，产生动态溶解－吸收过程[26]，当菌株吸收量大于溶解量时导致菌液中可溶性钾含量反而低于空白菌液，这种现象在固氮与溶磷菌株定量测试过程中也被发现。

图2 北柴胡内生真菌解钾(A)、固氮(B)、溶磷(C)、产铁载体(D)活性测定

共9 株测试菌株在阿须贝氏(Ashby)培养基上生长并产生暗色圈，显示出固氮活性，其BCS－467、BCS－500 与BCL－449 在定量测试过程中菌液可溶性氮含量增加量较高，具有较强的固氮活性，其中BCL－449 增量最高，为111.51 mg/L(图2B)。

共8 株菌株在无机磷筛选固体平板和有机磷筛选固体平板上产生透明圈，BCS－420、BCR－513与BCR－427 在溶解无机磷活性筛选定量测试中菌液可溶性磷含量增加量较高，具有较强的无机磷溶解活性，其中BCS－420 较空白培养液增量最大，为55.79 mg/L。 BCR－427、BCR－513、BCS－420、BCL－436 与BCL－449 在溶解有机磷活性筛选定量测试中菌液可溶性磷含量增量较大，具有较强的有机磷溶解活性，其中BCR－427 较空白培养液增量最大，为72.18 mg/L(图2C)。

共10 株待测真菌在CAS 平板上产生橙黄色光晕即噬铁圈，其中BCS－420、BCL－009、BCL－499 噬铁圈直径较大，分别为23.50、24.88 mm 及24.56 mm，具有较高产铁载体活性(图2D)。

2.4 分子鉴定及系统进化分析

综合抑菌活性及促生活性筛选结果，将高活性菌株5.8S rDNA－ITS 扩增片段在NCBI 网站GenBank 数据库中进行序列比对，主要功能菌株鉴定结果如表7 所示，挑选出吻合度超过99%的序列构建系统发育树(图3)。 活性菌株根据组群亲缘关系可以将除去Coprinus arachnoideus及Coprinellus xanthothrix剩余的菌株分成3 个种群，自检支持率分别为30%、81%和54%。

图3 基于5.8S rDNA－ITS 序列由邻近法构建的系统发育树

表7 主要功能菌株鉴定结果

3 讨论与结论

内生真菌一般存在于药用植物组织和器官中，具有产生植物生长调节剂类物质、提高宿主植物生理活性和抗逆性等功能，在植物生长发育中发挥重要作用[27]。 本研究从大田栽培北柴胡根、茎、叶中分离得到270 株内生真菌，青霉属(Penicillium)与生赤壳属(Bionectria)为根、叶部内生真菌优势属，链格孢属(Alternaria)和曲霉属(Aspergillus)为茎部内生真菌优势属，这与野生柴胡内生真菌根、茎、叶内生真菌分布具有一定的差异性[28]。

内生真菌分布不仅受宿主种类的影响，表现出宿主的特异性和组织的特异性，还受宿主植物生长环境、生长年限、生长阶段等因素的影响[29，30]。 如石斛内生真菌丰富度随石斛生长年限的增加而增加，不同地区的丹参内生真菌群落具有显著差异[31，32]；单叶蔓荆在沿海地区内生真菌腐生菌丰富度较大，这种变化能促进宿主在沙子掩埋期间增加营养吸收[33]；Martin 等[34]发现从自然发生病害的植物系统中更容易发现有效生防与促生作用菌株；内生真菌与宿主植物属于长期协同进化的共生关系，当宿主植物受到环境应激时，释放信号类似物可吸引某种微生物。 在制备内生真菌分离菌株材料时，可以以目标活性为导向选择或制造特定的应激环境。

北柴胡栽培生长过程中易感染多种疾病，尤以根腐病最为严重[35]。 研究发现非致病性的尖孢镰刀菌是天然真菌拮抗剂，也是潜在的生物防治剂，其释放的挥发性物质β－Caryophyllene 经研究证明具有促进植物生长的作用[36，37]。 茄腐镰刀菌代谢产生的多糖类物质是发挥抑菌性作用的物质基础，接种茄腐镰刀菌的番茄对病原微生物的防御作用明显增强[38，39]，其发酵产物具有作为生物技术应用的拮抗剂和抗菌剂的潜力。 本研究中BCR－097(茄腐镰刀菌)表现出较强抑菌活性，BCS－591(尖孢镰刀菌)则同时表现出较强的IAA分泌活性，这与以上研究存在相同点。

产生IAA 等植物生长激素和促进植物对氮、磷等营养元素的吸收是内生真菌促进植物生长主要作用方式[40]。 深绿木霉与哈茨木霉已被证明除生防作用外也具有较高促生活性，被广泛用于生物菌肥的开发[41]，但作为北柴胡内生菌，哈茨木霉与深绿木霉与北柴胡之间的作用机制仍值得进一步探索。 本研究中BCS－500(草酸青霉)、BCR－513(嗜松篮状菌)、BCR－098(辐毛小鬼伞菌)等表现出较强的促生活性。 有研究证明草酸青霉可显著提高水稻的抗旱能力[42]。 嗜松篮状菌具有产生β－葡聚糖酶、几丁质酶、铁载体及吲哚乙酸等活性，是近年来除木霉属真菌可用作生物增强剂的新型真菌[43]。 研究证明Coprinellus radians可有效降解邻苯二甲酸二丁酯及邻苯二甲酸二辛酯，可对污染土壤进行修复[44]。 综上，开发本研究中内生真菌用于北柴胡生物菌肥具有巨大潜力。

目前植物内生真菌用于农业生产仍面临诸多挑战，主要表现在微生物接种剂持久性短、适用面窄、波动性大等，而栽培管理措施、土壤条件、本土微生物菌落的拮抗作用都会对微生物接种剂效果产生影响[45]。 下一步应加强待开发菌株宿主相关昆虫影响的研究、组合不同优良菌株等措施进一步提高菌株开发水平和田间作用效果。