circRASSF2靶向miR-1343-3p对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

2023-07-17赵津津王振宇马贞秀

天津医药 2023年7期

赵津津，王振宇，马贞秀

乳腺癌是一种严重危害女性健康的恶性肿瘤，随着对乳腺癌发病机制认识的加深，分子靶向逐渐应用于乳腺癌的治疗［1-2］。确定潜在的分子靶标有助于开发新的靶向治疗药物。研究表明，circRNA在多种癌症中异常表达，可作为肿瘤诊断的生物标志物，可提供新的癌症治疗的靶标［3］。circRASSF2是位于20 号染色体且来源于Ras 相关序列家族2（ras association domain family 2，RASSF2）的一种circRNA。文献报道，circRASSF2在喉鳞状细胞癌组织和细胞系中显著上调，敲除circRASSF2 可通过上调miR-302b-3p/IGF-1R 轴显著抑制喉鳞癌细胞增殖和迁移［4］。circRASSF2在结直肠癌组织和细胞系中上调，敲除circRASSF2 可通过上调miR-195-5p、下调卷曲蛋白4（frizzled 4，FZD4）表达，从而抑制结直肠癌细胞的增殖并促进其凋亡［5］。然而，circRASSF2在乳腺癌中的作用及机制尚不清楚。在卵巢癌中，miR-1343-3p 表达下调，miR-1343-3p 的过表达可抑制卵巢癌的细胞生长和迁移［6］。LINC02323可通过海绵化miR-1343-3p促进肺腺癌的上皮-间质转化和转移［7］。lncRNA GAS8-AS1 通过靶向下调miR-1343-3p/自噬相关蛋白7 轴，从而促进甲状腺癌细胞的自噬［8］。据此，笔者认为miR-1343-3p 可能参与调控了多种癌症的进展。目前，miR-1343-3p 对乳腺癌的影响及其是否被circRASSF2 调控尚未知。本研究旨在探讨circRASSF2 对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响及其与miR-1343-3p的靶向调控关系。

1 材料与方法

1.1 主要材料

收集2021 年1 月—2022 年4 月于青海省第五人民医院收治的37例乳腺癌患者的癌及癌旁组织，均为手术切除后超低温冰箱内保存。乳腺癌细胞株MDA-MB-231（上海烜雅生物科技有限公司）；转染物si-circRASSF2及其阴性对照物si-NC，miR-1343-3p 及其阴性对照物miR-NC（广州锐博生物有限公司）；Lipofectamine®2000 Transfection Reagentt 转染试剂购自美国Invitrogen公司；抗体Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9（英国abcam 公司）；Trizol 试剂、逆转录荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）试剂盒（日本Takara公司）；蛋白提取试剂盒（上海臻诺生物科技有限公司）；四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）试剂盒、凋亡试剂盒（日本同仁研究所）；RPMI-1640培养基（美国Gibco 公司）；双荧光素酶报告实验试剂盒（上海泽叶生物科技有限公司）；T100PCR仪（美国Bio-Rad公司）；Multiskan GO 酶标仪、Western blot 系统、凝胶成像分析系统和细胞培养箱（美国赛默飞世尔公司）；FACSAria™Fusion 流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 细胞转染与分组

将MDA-MB-231 细胞培养于RPMI-1640 培养基中，至对数生长期时按5.0×105个/孔接种至96 孔板。将细胞分为miR-1343-3p 组（转染miR-1343-3p）、si-circRASSF2 组（转染si-circRASSF2）、si-NC 组（转染si-NC）、miR-NC 组（转染miR-NC）、si-circRASSF2+anti-miR-1343-3p 组（共转染sicircRASSF2 和anti-miR-1343-3p）及si-circRASSF2+antimiR-NC组（共转染si-circRASSF2和anti-miR-NC）。

1.3 RT-qPCR 检测circRASSF2、miR-1343-3p 的相对表达水平

取乳腺癌组织、癌旁组织及各组细胞，加入Trizol 试剂提取总RNA，取200 ng RNA 逆转录合成cDNA，以cDNA 为模板进行PCR。circRASSF2引物序列：上游5'-CTTTTCAAA GAGAGTGGCCCAG-3'，下游5'-ACGGTGTACTTGCGCATCA G-3'；miR-1343-3p：上游5'-CGAAGTTCCCTTTGTCATCCT-3'，下游5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'；GAPDH：上游5'-AGTCAGGCTGGGGCTCATTG-3'，下游5'-AGGGGCCATC CACAGTCTTC-3'；U6：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。反应条件：94 ℃2 min；94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃60 s，循环30 次。GAPDH和U6 分别为circRASSF2 和miR-1343-3p 的内参基因，采用2-ΔΔCt法计算circRASSF2、miR-1343-3p相对表达量。

1.4 MTT法检测细胞活性

各组细胞培养48 h后接种于96孔板（200µL，3×103个/孔）。每孔加10µL MTT 试剂（5 g/L），培养4 h加入150µL DMSO，多功能酶标仪检测490 nm波长处光密度（OD）值。

1.5 克隆形成实验检测细胞克隆形成数

分别取各组细胞并接种至6 孔板（1×103个/孔），37 ℃培养2 周。磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2 次，加入甲醇固定2～3 min 后滴加吉姆萨染色液染色，于光学显微镜下计数克隆形成数（＞50个细胞）。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

转染48 h 后用0.125%胰蛋白酶制备细胞悬液，室温250×g离心5 min，用4 ℃预冷PBS 洗涤2 次后将细胞重悬于结合缓冲液，浓度为1×106个/mL。随后，在暗室中用Annexin V-FITC和PI孵育15 min；上流式细胞仪检测，FlowJo 7.6.1分析细胞凋亡情况。

1.7 Western blot 检测Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白相对表达水平

取各组细胞，通过蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，进行蛋白定量后行SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜、封闭，加Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9 一抗稀释液（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，加二抗（1∶2 000）室温孵育2 h，曝光显影，Image Lab软件分析各蛋白条带灰度值。

1.8 双荧光素酶实验检测circRASSF2 和miR-1343-3p 的靶向关系

采用Starbase 软件（https://starbase.sysu.edu.cn/）预测circRASSF2与miR-1343-3p有无结合位点。将野生型（WT）和突变型（MUT）circRASSF2 双荧光素酶报告载体、miR-NC及miR-1343-3p共转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231，48 h后按照试剂盒说明书检测miR-NC组和miR-1343-3p组细胞中circRASSF2 荧光素酶相对活性。分别将pcDNA、pcDNAcircRASSF2、si-circRASSF2、si-NC 转染MDA-MB-231 细胞，记为pcDNA组、pcDNA-circRASSF2组、si-circRASSF2组、si-NC组，按照1.3方法检测各组miR-1343-3p表达水平。

1.9 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，2组间比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circRASSF2、miR-1343-3p在乳腺癌中的表达

与癌旁组织比较，乳腺癌组织中circRASSF2 表达水平升高，miR-1343-3p 表达水平降低（P＜0.01），见表1。

Tab.1 Comparison of circRASSF2 and miR-1343-3p expression levels between breast cancer tissue and paracancer tissue表1 乳腺癌组织和癌旁组织中circRASSF2和miR-1343-3p的表达水平比较（n=37，±s）

＊＊P＜0.01。

组织癌旁组织乳腺癌组织t circRASSF2 1.00±0.02 4.03±0.21 89.518＊＊miR-1343-3p 1.00±0.05 0.37±0.03 60.709＊＊

2.2 si-NC组和si-circRASSF2组细胞增殖水平比较

与si-NC 组比较，si-circRASSF2 组circRASSF2表达水平和MDA-MB-231细胞活性降低，细胞克隆形成数减少（P＜0.01），见图1、表2。

Tab.2 Comparison of cell proliferation between the si-NC group and the si-circRASSF2 group表2 si-NC组和si-circRASSF2组细胞增殖水平比较（n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

组别si-NC组si-circRASSF2组t circRASSF2 1.00±0.06 0.34±0.02 19.219＊＊OD490 0.71±0.06 0.34±0.03 9.992＊＊克隆形成数/个101.25±8.96 48.79±2.34 9.815＊＊

2.3 si-NC组和si-circRASSF2组细胞凋亡比较

与si-NC组比较，si-circRASSF2组细胞凋亡率、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9 表达水平升高（P＜0.01），见图2、3，表3。

Fig.2 Apoptosis of the si-NC group and the si-circRASSF2 group图2 si-NC组和si-circRASSF2组细胞凋亡情况

Fig.3 Expression levels of apoptosis related proteins in the si-NC group and the si-circRASSF2 group图3 si-NC组和si-circRASSF2组细胞凋亡相关蛋白表达

Tab.3 Comparison of apoptosis rate and related protein expression levels between the si-NC group and the si-circRASSF2 group表3 si-NC组和si-circRASSF2组细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达比较（n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

组别si-NC组si-circRASSF2组t细胞凋亡率/%8.75±0.13 23.89±3.21 8.156＊＊Cleavedcaspase 3 0.27±0.04 0.75±0.09 8.486＊＊Cleavedcaspase 9 0.20±0.02 0.54±0.06 10.304＊＊

2.4 circRASSF2靶向调控miR-1343-3p

circRASSF2与miR-1343-3p存在互补的核苷酸序列，见图4。与miR-NC 组比较，miR-1343-3p 组WT-circRASSF2 荧光素酶活性降低（t=9.076，P＜0.05），而2 组MUT-circRASSF2 荧光素酶活性差异无统计学意义（t=0.475，P＞0.05），见图5A。RT-qPCR结果显示，与pcDNA 组比较，pcDNA-circRASSF2 组miR-1343-3p 表达水平降低（t=51.898，P＜0.05），与si-NC组比较，si-circRASSF2组miR-1343-3p表达水平升高（t=23.106，P＜0.05），见图5B。

Fig.4 Binding sequence of circRASSF2 and miR-1343-3p图4 circRASSF2与miR-1343-3p的结合序列

Fig.5 circRASSF2 targeting regulates the expression of miR-1343-3p图5 circRASSF2靶向调控miR-1343-3p的表达

2.5 miR-NC 组和miR-1343-3p 组乳腺癌MDAMB-231细胞增殖、凋亡水平比较

与miR-NC组比较，miR-1343-3p组miR-1343-3p 表达水平升高，细胞凋亡率升高，Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9 表达水平升高，细胞活性下降，克隆形成数减少（P＜0.01），见图6、7，表4。

Fig.6 Clonal formation and apoptosis in the miR-NC group and the miR-1343-3p group图6 miR-NC组和miR-1343-3p组细胞克隆形成和凋亡

Fig.7 Expression of apoptosis related proteins in the miR-NC group and the miR-1343-3p group图7 miR-NC组和miR-1343-3p组细胞凋亡相关蛋白表达

Tab.4 Comparison of proliferation and apoptosis between the miR-NC group and the miR-1343-3p group表4 miR-NC组和miR-1343-3p组细胞增殖和凋亡比较（n=3，±s）

＊＊P＜0.01。表5同。

组别miR-NC组miR-1343-3p组t miR-1343-3p 1.01±0.02 3.21±0.13 28.357＊＊OD490 0.70±0.05 0.42±0.03 9.058＊＊克隆形成数/个99.87±8.43 50.23±2.45 9.794＊＊细胞凋亡率/%7.48±0.51 19.96±2.03 10.317＊＊Cleaved-caspase 3 0.25±0.03 0.73±0.08 9.821＊＊Cleaved-caspase 9 0.19±0.02 0.48±0.05 10.793＊＊

2.6si-circRASSF2+anti-miR-NC 组和 sicircRASSF2+anti-miR-1343-3p 组乳腺癌MDAMB-231细胞增殖和凋亡比较

与si-circRASSF2+anti-miR-NC 组比较，sicircRASSF2+anti-miR-1343-3p 组miR-1343-3p 表达水平、细胞凋亡率、Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9 表达水平降低，细胞活性和克隆形成数升高（P＜0.05），见表5，图8、9。

Fig.8 Clonal formation and apoptosis in the si-circRASSF2+antimiR-NC group and the si-circRASSF2+anti-miR-1343-3p group图8 si-circRASSF2+anti-miR-NC组和si-circRASSF2+anti-miR-1343-3p组细胞克隆形成和凋亡

Tab.5 Proliferation and apoptosis in the si-circRASSF2+anti-miR-NC group and the si-circRASSF2+anti-miR-1343-3p group表5 si-circRASSF2+anti-miR-NC组和si-circRASSF2+anti-miR-1343-3p组细胞增殖和凋亡（n=3，±s）

组别si-circRASSF2+anti-miR-NC组si-circRASSF2+anti-miR-1343-3p组t miR-1343-3p 1.00±0.03 0.28±0.02 35.040＊＊OD490 0.39±0.02 0.65±0.04 10.373＊＊克隆形成数/个40.78±3.51 82.63±8.74 7.696＊＊细胞凋亡率/%27.45±3.11 12.13±0.98 8.140＊＊Cleavedcaspase 3 0.75±0.09 0.32±0.04 7.460＊＊Cleavedcaspase 9 0.52±0.06 0.24±0.02 7.545＊＊

3 讨论

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其治疗方法包括手术、化疗和免疫治疗，然而由于局部复发和转移发生率较高，晚期乳腺癌患者预后仍然很差［9］。因此，确定新的生物标志物对开发乳腺癌新靶向治疗很有必要。研究显示，circRNA 参与调控乳腺癌的恶性生物学行为，如circ_0025202 可以抑制乳腺癌细胞的增殖、集落形成和迁移，并增加癌细胞凋亡［10］。沉默circ_0004771 通过靶向miR-653/ZEB2以抑制乳腺癌的增殖并诱导其凋亡［11］。Zhong 等［12］研究显示，circRASSF2 在乳腺癌组织和血清中表达增加，敲除circRASSF2 后乳腺癌细胞的增殖能力下降。本研究结果亦显示，circRASSF2 在人乳腺癌组织中表达水平升高，抑制circRASSF2 表达可降低MDA-MB-231 细胞增殖活性，并使细胞凋亡率升高，表明抑制circRASSF2 可促进乳腺癌细胞凋亡和抑制癌细胞增殖，提示circRASSF2 的失调参与了乳腺癌的进展。

通过生物信息学分析发现，circRASSF2 可以靶向调控各种miRNAs 表达。本研究选择了其中的miR-1343-3p 作为circRASSF2 的靶点。研究显示，miR-1343-3p 在胰腺癌中低表达，LINC01559 通过充当miR-1343-3p的竞争性内源RNA 来上调RAF1表达，从而促进胰腺癌的进展［13］。LINC01559 海绵化miR-1343-3p，上调PGK1，激活PI3K/AKT 途径，进而促进胃癌的发展［14］。EIF3J-AS1 通过海绵化miR-1343-3p 上调ANXA11 表达，从而促进神经胶质瘤细胞增殖［15］。本研究结果显示，在乳腺癌组织中miR-1343-3p低表达，且miR-1343-3p过表达后，细胞活性、克隆形成数下降，凋亡率升高，表明上调miR-1343-3p表达可抑制乳腺癌细胞增殖和促进细胞凋亡，提示miR-1343-3p 具有抗乳腺癌作用。通过双荧光素酶报告基因检测验证了circRASSF2 与miR-1343-3p有靶向关系，发现两者表达水平相反。在检测细胞增殖和凋亡后，本研究发现circRASSF2敲除对乳腺癌细胞的影响可以通过抑制miR-1343-3p表达部分逆转，提示抑制circRASSF2表达可通过上调miR-1343-3p，从而抑制MDA-MB-231 细胞增殖并促进其凋亡。

综上所述，circRASSF2在乳腺癌中高表达，抑制circRASSF2可通过上调miR-1343-3p来抑制乳腺癌细胞增殖，并促进细胞凋亡。circRASSF2 通过下调miR-1343-3p的表达，促进乳腺癌增殖并阻碍凋亡，circRASSF2有望成为乳腺癌的潜在诊断生物标志物和治疗靶点。然而，由于本研究所纳入的临床标本有限，且检测手段单一、缺乏体内实验等，因此后续需针对此类问题进行完善和深入探讨。