木犀草苷对阿尔茨海默病模型细胞凋亡和炎性因子表达的研究

2023-07-17王翠杨畅金玉高蜜张雯王琼金海涛

天津医药 2023年7期

王翠，杨畅，金玉，高蜜，张雯，王琼，金海涛△

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是造成老年痴呆的常见原因，发病率随人口老龄化的加剧逐年增加，85 岁以上老人发病率高达10%［1］。研究显示，β 淀粉样蛋白（Aβ）可造成神经细胞凋亡及过度炎症反应，是诱发AD 的主要因素［2］。因此，抑制Aβ诱导的神经细胞凋亡及炎症反应对治疗AD尤为重要。木犀草苷是一种在植物中广泛存在黄酮类化合物。木犀草苷可抑制过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）氧化损伤［3］，还可减少缺氧缺糖诱导的大鼠皮质神经细胞凋亡［4］，具有治疗脑血管疾病的潜在价值。但木犀草苷能否影响AD 发生发展还未知。有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 3，MEKK3）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与调控细胞生长、凋亡、炎症反应等生命活动。研究显示，MEKK3在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶诱导的帕金森病模型细胞中表达增加，敲减MEKK3可通过阻碍核转录因子κB（nuclear factor kappa B，NFκB）信号通路的激活，抑制帕金森病模型细胞促炎细胞因子表达，减轻细胞损伤［5］。AD与帕金森病均属于神经退行性疾病，因此，推测MEKK3 可能也参与AD的发展进程。本研究利用Aβ25-35诱导PC12细胞建立AD模型，主要观察木犀草苷对AD模型细胞凋亡、炎性因子表达的影响，并以MEKK3为切入点，探究木犀草苷影响AD模型细胞凋亡、炎性因子表达的机制，为其用于治疗AD提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂与仪器

PC12细胞（上海弘顺生物科技有限公司）；木犀草苷（规格50 mg，上海邦景实业有限公司）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司）；Aβ25-35（美国Sigma 公司）；DMEM培养液、LipofectamineTM2000 试剂盒、细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡试剂盒、二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；MEKK3小分子干扰RNA（si-MEKK3）及其阴性对照（si-NC）、MEKK3 过表达载体质粒（pcDNA-MEKK3）及其阴性对照（pcDNA）购自广州锐博生物科技有限公司；兔源一抗［MEKK3、甘油醛-3- 磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）］、山羊抗兔二抗（英国Abcam公司）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNFα）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。HERAcell 240i CO2细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；iMark680 多功能酶标仪（美国Bio-Rad 公司）；FACSCalibur 流式细胞仪（美国Becton-Dickinson公司）；BX61光学显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

复苏PC12细胞，用含10%FBS的DMEM培养液制成单细胞悬液，接种至25 cm2培养瓶中，于CO2培养箱（37 ℃、5%CO2）中培养。

1.2.2 细胞分组

实验一：PC12 细胞分为对照组，模型组及模型+木犀草苷低、中、高剂量组。模型+木犀草苷低、中、高剂量组先分别用含6.25、12.5、25 mg/L［4］木犀草苷的培养液孵育细胞24 h，再用含25µmol/L［6］Aβ25-35的培养液孵育24 h；模型组先用不含木犀草苷的培养液孵育细胞24 h，再用含25µmol/L Aβ25-35的培养液孵育24 h；对照组用不含木犀草苷及Aβ25-35的培养液孵育细胞48 h。实验二：将PC12 细胞接种至6 孔板中（1.0×105个/孔），培养24 h 后，利用LipofectamineTM2000 试剂盒分别转染si-MEKK3、si-NC、pcDNA-MEKK3、pcDNA。转染12 h，Western blot 检测MEKK3 蛋白表达验证转染效果。转染后的PC12 细胞接种至培养板中，先用不含木犀草苷的培养液孵育细胞24 h，再用含25µmol/L Aβ25-35的培养液孵育24 h，分别记为模型+si-MEKK3 组、模型+si-NC 组、模型+pcDNA-MEKK3 组、模型+pcDNA-NC 组。实验三：将转染pcDNA-MEKK3、pcDNA 的PC12 细胞先用含25 mg/L 木犀草苷的培养液孵育细胞24 h，再用含25 µmol/L Aβ25-35的培养液孵育24 h，分别记为模型+木犀草苷+pcDNA-MEKK3 组、模型+木犀草苷+pcDNA组。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖抑制率

接种PC12 细胞至96 孔板中（2.5×104个/孔），培养12 h后，按照上述1.2.2分组干预。干预后，加CCK-8（10µL/孔），孵育2 h。将96孔板置于酶标仪卡槽，设置波长为450 nm，测定各孔光密度（OD）值。增殖抑制率（%）=（1-OD实验组/OD对照组）/OD对照组×100%。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率

接种PC12细胞至6孔板中（1.0×105个/孔），培养12 h后，按照上述1.2.2分组干预。干预后，收集各组细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2 次，300×g离心5 min，弃上清液。加Binding Buffer 重悬细胞，并调整细胞密度为1.0×106个/mL。取100µL细胞悬液，加Annexin V-FITC（5µL/管），室温避光孵育10 min。再加5µL PI，室温避光孵育5 min。加500µL Binding Buffer，混合均匀，在1 h内用流式细胞仪检测。

1.2.5 ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1β水平

接种PC12细胞至6孔板中（1.0×105个/孔），培养12 h后，按照上述1.2.2 分组干预。干预后，收集各组细胞，500×g离心5 min。取上清液，采用ELISA 试剂盒检测TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.2.6 Western blot检测MEKK3蛋白表达

接种PC12细胞至6孔板中（1.0×105个/孔），培养12 h后，按照上述1.2.2 分组干预。干预后，收集各组细胞，加PBS 清洗2次，300×g离心5 min，弃上清液。用RIPA 试剂提取总蛋白并测定（BCA法）蛋白浓度。行SDS-PAGE分离总蛋白，并转至PVDF 膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h。于4 ℃冰箱中分别用MEKK3（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）一抗孵育12 h，再于室温下用山羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育2 h。滴加显影液，避光显影，曝光拍照，Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以MEKK3 与GAPDH 灰度值的比值表示MEKK3 蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示；多组间比较用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t检验；2 组间比较行独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 木犀草苷对AD模型细胞增殖与凋亡的影响

与对照组比较，模型组PC12 细胞增殖抑制率、凋亡率升高（P＜0.05）；与模型组比较，模型+木犀草苷低、中、高剂量组PC12细胞增殖抑制率、凋亡率依次降低（P＜0.05），见图1，表1。

Tab.1 Effects of cynaroside on proliferation inhibition rate and apoptosis rate of AD model cells表1 木犀草苷对AD模型细胞增殖抑制率与凋亡率的影响（n=9，%，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比，b与模型组比，c与模型+木犀草苷低剂量组比，d与模型+木犀草苷中剂量组比，P＜0.05。

组别对照组模型组模型+木犀草苷低剂量组模型+木犀草苷中剂量组模型+木犀草苷高剂量组F增殖抑制率0.02±0.01 44.15±1.84a 32.36±1.84b 24.06±1.28bc 12.45±0.71bcd 1 482.537＊＊凋亡率6.35±0.16 23.83±0.88a 20.37±0.89b 16.29±1.12bc 11.93±0.56bcd 675.957＊＊

Fig.1 Effect of cynaroside on apoptosis of AD model cells detected by flow cytometry图1 流式细胞术检测木犀草苷对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡的影响

2.2 木犀草苷对AD模型细胞炎性因子表达的影响

与对照组比较，模型组TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，模型+木犀草苷低、中、高剂量组TNF-α、IL-6、IL-1β 水平依次降低（P＜0.05），见表2。

Tab.2 Effects of cynaroside on the expression of inflammatory cytokines and MEKK3 protein in AD model cells表2 木犀草苷对AD模型细胞炎性因子表达和MEKK3蛋白表达水平的影响（n=9，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比，b与模型组比，c与模型+木犀草苷低剂量组比，d与模型+木犀草苷中剂量组比，P＜0.05。

组别对照组模型组模型+木犀草苷低剂量组模型+木犀草苷中剂量组模型+木犀草苷高剂量组F TNF-α/（ng/L）100.06±5.79 400.08±14.63a 332.88±20.38b 244.86±12.78bc 148.91±11.88bcd 721.179＊＊IL-6/（ng/L）64.78±4.99 442.40±32.12a 303.79±15.73b 222.45±14.55bc 126.42±9.40bcd 621.541＊＊组别对照组模型组模型+木犀草苷低剂量组模型+木犀草苷中剂量组模型+木犀草苷高剂量组F IL-1β/（ng/L）93.60±5.55 275.42±20.46a 235.50±13.86b 176.98±12.97bc 125.28±8.96bcd 286.230＊＊MEKK3 0.15±0.02 0.67±0.04a 0.51±0.03b 0.39±0.04bc 0.22±0.02bcd 411.612＊＊

2.3 木犀草苷对AD 模型细胞中MEKK3 蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组MEKK3 蛋白水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，模型+木犀草苷低、中、高剂量组MEKK3 蛋白水平依次降低（P＜0.05），见图2，表2。

Fig.2 Western blot detection of the effect of cynaroside on the expression of MEKK3 protein in AD model cells图2 Western blot检测木犀草苷对AD模型细胞中MEKK3蛋白表达的影响

2.4 MEKK3转染效果验证

与si-NC 组比较，si-MEKK3 组MEKK3 蛋白表达量降低，差异有统计学意义（0.15±0.01vs.0.05±0.01，t=21.213，P＜0.05）；与pcDNA 组比较，pcDNAMEKK3 组MEKK3 蛋白表达量升高，差异有统计学意义（0.15±0.01vs.0.49±0.04，t=24.739，P＜0.05），见图3。

Fig.3 Western blot detection of the effect of transfection on MEKK3 protein expression图3 Western blot检测转染对MEKK3蛋白表达的影响

2.5 敲减MEKK3 对AD 模型细胞损伤及炎性因子表达的影响

与模型+si-NC组比较，模型+si-MEKK3组PC12细胞增殖抑制率、凋亡率、炎性因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）水平降低（P＜0.01），见图4，表3。

Tab.3 Effects of knockdown of MEKK3 on proliferation inhibition rate,apoptosis rate and expression of inflammatory factors in AD model cells表3 敲减MEKK3对AD模型细胞增殖抑制率、凋亡率及炎性因子表达的影响（n=9，±s）

＊＊P＜0.01。表4、5同

组别模型+si-NC组模型+si-MEKK3组t增殖抑制率/%44.19±1.96 14.56±0.83 41.762＊＊凋亡率/%23.65±1.58 13.35±0.97 16.667＊＊TNF-α/（ng/L）399.83±23.91 198.54±19.89 19.416＊＊IL-6/（ng/L）448.76±20.57 144.50±22.08 30.248＊＊IL-1β/（ng/L）272.70±35.62 133.54±10.81 11.215＊＊

Fig.4 The effect of knockout MEKK3 on apoptosis of AD model cells detected by flow cytometry图4 流式细胞术检测敲减MEKK3对AD模型细胞凋亡的影响

2.6 过表达MEKK3 对AD 模型细胞损伤及炎性因子表达的影响

与模型+pcDNA 组比较，模型+pcDNA-MEKK3组PC12 细胞增殖抑制率、凋亡率、炎性因子（TNFα、IL-6、IL-1β）水平升高（P＜0.01），见图5，表4。

Tab.4 Effects of overexpression of MEKK3 on proliferation inhibition rate,apoptosis rate and expression of inflammatory factors in AD model cells表4 过表达MEKK3对AD模型细胞增殖抑制率、凋亡率及炎性因子表达的影响（n=9，±s）

组别模型+pcDNA组模型+pcDNA-MEKK3组t增殖抑制率/%42.35±2.05 60.18±3.72 12.593＊＊凋亡率/%21.74±1.50 36.28±2.15 16.639＊＊TNF-α/（ng/L）387.96±25.39 562.30±40.15 11.010＊＊IL-6/（ng/L）439.55±31.42 641.07±45.19 10.984＊＊IL-1β/（ng/L）280.14±22.90 435.80±30.57 12.226＊＊

Fig.5 Effects of overexpression of MEKK3 on apoptosis of AD model cells detected by flow cytometry图5 流式细胞术检测过表达MEKK3对AD模型细胞凋亡的影响

2.7 上调MEKK3 恢复木犀草苷对AD 模型细胞损伤及炎性因子表达的影响

与模型+木犀草苷+pcDNA 组比较，模型+木犀草苷+pcDNA-MEKK3 组PC12 细胞增殖抑制率、凋亡率、炎性因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）水平升高（P＜0.05），见图6，表5。

Tab.5 Effects of up-regulation of MEKK3 to restore on inhibition rate of proliferation,apoptosis rate and expression of inflammatory factors in AD model cells表5 上调MEKK3恢复木犀草苷对AD模型细胞增殖抑制率、凋亡率及炎性因子表达的影响（n=9，±s）

组别模型+木犀草苷+pcDNA组模型+木犀草苷+pcDNA-MEKK3组t增殖抑制率/%12.48±0.78 33.27±1.87 30.782＊＊凋亡率/%11.67±0.62 21.07±0.83 27.220＊＊TNF-α/（ng/L）142.99±17.36 348.56±19.04 23.935＊＊IL-6/（ng/L）126.56±9.61 347.98±20.81 28.979＊＊IL-1β/（ng/L）133.38±15.76 238.75±17.50 13.423＊＊

Fig.6 Effects of up-regulation of MEKK3 on cell apoptosis in AD model cells mediated by cynaroside detected by flow cytometry图6 流式细胞术检测上调MEKK3对木犀草苷介导的AD模型细胞凋亡的影响

3 讨论

AD 以渐进性记忆障碍、人格改变、智力减退等认知功能障碍为主要特征，其危害仅次于肿瘤、心血管疾病、脑卒中。目前，AD发病机制尚未完全阐明，其中Aβ在AD 患者大脑中沉积，可影响神经细胞骨架完整性，且通过干扰线粒体功能发挥细胞毒性致细胞损伤［7］。PC12细胞为大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤分化细胞株，具有神经细胞特性，因此常用Aβ 诱导PC12 细胞建立AD 模型［8］。本研究结果显示，PC12 细胞经Aβ25-35诱导后，细胞增殖活性降低，凋亡增加，PC12细胞发生损伤，模型建立成功。

目前AD 缺乏有效的治疗药物，针对AD 发病机制不同靶点的药物开发尚处于试验阶段。天然植物活性成分因毒性低、作用靶点多、疗效强等优点成为AD治疗药物的重点研究对象。木犀草苷具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等功效［9-10］。研究显示，木犀草苷可抑制脂多糖诱导的HUVECs 分泌炎性因子和黏附因子，减轻HUVECs损伤［11］。本研究结果显示，木犀草苷可提高Aβ25-35诱导后PC12细胞增殖活性，并减少细胞凋亡，提示木犀草苷可减轻Aβ25-35诱导PC12细胞损伤，具有治疗AD的潜在价值。炎症是AD发病机制之一，Aβ大量堆积可诱发神经细胞产生过度炎症反应，分泌大量炎性因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β，这些炎性因子进一步损伤神经细胞，加快AD发展进程［12］。在本实验中，木犀草苷可抑制Aβ25-35诱导PC12 细胞分泌TNF-α、IL-6 和IL-1β，提示木犀草苷可减轻Aβ25-35诱导PC12细胞炎性损伤，这也可能是其减轻Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的机制之一。

MEKK3 属于丝裂原活化蛋白3 激酶家族成员，可通过激活细胞外信号调节激酶、NF-κB、p38 等多种信号通路调控细胞凋亡及炎症反应过程。研究显示，MEKK3 的异常表达与人类肿瘤、心脑血管疾病等多种疾病的发生发展密切相关［13-14］。据报道，在糖尿病小鼠中，MEKK3 可通过诱导p38 MAPK/NFκB通路的激活，加重2型糖尿病的认知缺陷，进而导致糖尿病脑病［15］；此外，创伤性脑损伤小鼠皮质和海马中MEKK3 表达增加，下调MEKK3 可减轻氧糖剥夺/再灌注诱导的原代皮层神经元和神经胶质细胞凋亡及神经炎症［16］。在本研究中，Aβ25-35诱导PC12细胞中MEKK3 蛋白表达增加，敲减MEKK3 可抑制Aβ25-35诱导PC12 细胞凋亡、炎性因子表达，而过表达MEKK3 表现出相反作用，提示MEKK3 也具有作为AD 治疗分子靶点的潜力。同时，本研究结果显示，木犀草苷可抑制Aβ25-35诱导PC12细胞中MEKK3蛋白表达，而上调MEKK3可减弱木犀草苷对Aβ25-35诱导PC12 细胞增殖活性、凋亡、炎性因子表达的影响，这提示木犀草苷可能通过下调MEKK3 表达，抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤。

综上，木犀草苷可抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡和炎性因子表达，有可能成为治疗AD 的药物，其作用机制可能与下调细胞中MEKK3 表达有关。但本研究仅通过体外细胞实验进行了探究，尚需进一步在体内观察木犀草苷治疗AD 的疗效性和安全性。