朱琏抑制Ⅱ型针法干预盆腔炎性疾病后遗症大鼠的效果及其对前列腺素、VEGF、MMP2表达的影响▲

黄敬文 范郁山 麦 威 张 卉 贺煜俊 黄梓欣

(广西中医药大学针灸推拿学院,广西南宁市 530001)

盆腔炎性疾病是一种妇科炎症性疾病,发病率高,若未能得到及时、彻底的治疗可导致不孕、输卵管妊娠、慢性盆腔痛及炎症反复发作,从而严重影响妇女的生殖健康[1-2]。盆腔炎性疾病的病原体包括外源性病原体(如沙眼衣原体、淋病奈瑟菌)及寄居于阴道的菌群,但由于其发生部位较深,病原体种类繁多且培养标本不易采集,患者症状、体征不典型且轻重不一,因此该病的治疗存在一定的困难,其诊断和治疗难以规范[3-4]。盆腔炎性疾病在急性发作期如未能得到及时有效的治疗,迁延日久则发展为盆腔炎性疾病后遗症(sequelae of pelvic inflammatory disease,SPID)[5]。西医治疗SPID以口服抗生素药物为主,必要时给予手术治疗。然而,抗生素具有一定的副作用,手术则会增加患者感染风险。在中医临床领域中,针灸治疗SPID已形成较为完整的治疗理论与体系。朱琏针法为现代针灸家朱琏所创,总体上分为兴奋型与抑制型,每种分型又细分为两种。其中朱琏抑制Ⅱ型针法手法刺激感强烈,延续时间较长,又称为强刺激法。朱琏抑制Ⅱ型针法可用于治疗因炎症反应而产生疼痛的疾病[6],机体功能处于亢进时,其能够起到镇痛、舒缓的作用,在治疗SPID的炎症反应中具有很强的针对性。但朱琏抑制Ⅱ型针法治疗SPID的具体作用机制尚待研究。

有研究显示,前列腺素(prostaglandin,PG)水平的改变是盆腔炎性疾病的重要诱因之一。作为一种重要的炎症因子,PG增高会引起子宫平滑肌及血管收缩缺血,引发疼痛[7-8];基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2是MMP基因家族的成员,是一种能够切割细胞外基质的成分和参与信号转导的分子,在炎症细胞因子刺激下其表达量会升高[9]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种促进血管生成的生长因子,VEGF表达变化与SPID的发展具有相关性[10]。因此,本研究选用成年雌性未孕SD大鼠,采用宫内接种混合菌液法制备SPID大鼠模型,检测朱琏抑制Ⅱ型针法干预后大鼠血清PGF2α、PGE2含量,以及子宫组织VEGF、MMP2蛋白表达水平,探讨朱琏抑制Ⅱ型针法治疗SPID的作用机制,为朱琏抑制Ⅱ型针法治疗SPID提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体级健康、雌性未孕SD大鼠55只,6周龄,体质量(200±20)g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供[许可证号:SCXK(湘)2019-0004]。将大鼠饲养于广西中医药大学中心温度为20 ℃、相对湿度为40%～60%的无特定病原体级动物实验室中,给予大鼠自由饮水摄食,并随时更换垫料。本实验方案通过广西中医药大学医学伦理委员会审查(审查证书编号:DW20220310-030)。

1.2 试剂与仪器 阿奇霉素片(中山可可康制药有限公司,国药准字H20066382)。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌[中国医学细菌菌种保藏管理中心,货号:CMCC(B)44102、CMCC(B)26003],化脓性链球菌(美国菌种保藏中心,货号:ATCC19615)。大鼠PGF2αELISA测定试剂盒(厦门仑昌硕生物科技有限公司,货号:YD-30699),大鼠PGE2ELISA测定试剂盒(厦门仑昌硕生物科技有限公司,货号:YD-30697),兔单克隆VEGF抗体(Abcam公司,货号:ab32152),兔单克隆MMP2抗体(Abcam公司,货号:ab92536),二喹啉甲酸检测试剂盒(Solarbio Science &Technology Co.,Ltd.,货号:PC0020),内参β-actin(ABclonal公司,货号:AC026),山羊抗兔IgG(Abcam公司,货号:ab6721),山羊抗小鼠IgG(Abcam公司,货号:ab6789)。云龙牌针灸针(0.25 mm×25 mm,吴江市云龙医疗器械有限公司);自动组织脱水机(Thermo Fisher Scientific 公司,型号:Excelsior AS),组织切片机[徕卡显微系统(上海)贸易有限公司,型号:2235],组织摊片机[徕卡显微系统(上海)贸易有限公司,型号:HI1210],组织烤片机[徕卡显微系统(上海)贸易有限公司,型号:HI1210];电热干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司,型号:DHG-9091A),恒温培养箱(上海申贤恒温设备厂,型号:DHP-90052),通风柜(广东汇绿实验室设备科技有限公司,型号:630),光学显微镜(OLYMPUS公司,型号:BX-53),低温离心机(Eppendorf公司,型号:5418R),组织匀浆机(IKA集团,型号:T18),金属恒温水浴锅(上海齐欣科学仪器有限公司,型号:HWS-28),多功能酶标仪(Molecular Devices公司,型号:FilterMax F3),普通离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司,型号:TD4),水平摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司,型号:TS-3D),电泳仪(Bio-Rad公司,型号:PowerPac Basic),蛋白转印系统(Bio-Rad公司,型号:Mini Trans-Blot Cell),凝胶成像系统(上海天能科技有限公司,型号:Tanon 5200),恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司,型号:ZWYR-2102C)。

1.3 造模方法 将55只SD雌性大鼠适应性喂养1周。采用随机数字表法将大鼠分为空白组、模型组、西药组、普通针刺组(普针组)、朱琏抑制Ⅱ型针法组(针法组),每组11只。除空白组外,其余各组大鼠通过宫内注射混合菌液联合机械损伤法[11-12]制备SPID大鼠模型。在禁食12 h后,给予大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.4 mg/100 g),待大鼠处于完全深度麻醉后施行手术。将大鼠置于手术台(仰卧位),固定四肢,下腹部除毛后使用碘附消毒。沿下腹部正中线偏下位置做一长为1 cm的纵向切口,打开切口充分暴露子宫,用1 mL注射器向一侧宫腔注射0.2 mL混合菌液,注射完成后使用注射针头刮擦宫腔,以造成机械损伤,然后在另一侧进行相同操作。操作结束后将子宫复位,缝合切口并消毒周围皮肤。术后5 d内定期对大鼠切口进行消毒。各组分别于造模后2周随机抽取1只大鼠用于评估造模情况,给予大鼠腹腔麻醉后切开腹部,充分暴露子宫,如通过肉眼观察可见大鼠子宫肿胀充血、色泽暗红、双侧形态不对称,输卵管迂曲、硬化、增粗,盆腔组织广泛粘连且有积液填充,则提示造模成功。

1.4 干预方法 造模成功后,不给予空白组与模型组任何治疗手段。给予西药组灌胃阿奇霉素:使用4.8 mL 0.9%氯化钠注射液将500 mg阿奇霉素充分溶解,配置成100 mg/mL的阿奇霉素溶液,按每日45 mg/kg灌胃,1次/d,连续灌胃4周。给予普针组普通针刺治疗:参考《大鼠穴位图谱的研制》[13]的穴位进行选穴,直刺中极穴(脐下约30 mm处)、双侧三阴交穴(后肢内踝尖直上10 mm处),用提插泻法进行针刺,其间不行针,留针15 min后出针,1次/d,连续干预4周。给予针法组朱琏抑制Ⅱ型针法治疗:选穴同普针组,采用朱琏缓慢捻进针法进针,在穴位处慢慢捻动针柄,捻动几次稍停,以产生“虚捻”的感觉,然后再捻,逐渐向下加力,深刺至筋层后,缓慢捻转、提插[6],进针耗时2 min,留针15 min后,采用平稳拔出法出针,1次/d,连续干预4周。

1.5 标本采集 末次干预结束后给予大鼠禁食,次日腹腔注射10%水合氯醛(0.4 mg/100 g),成功麻醉后,取腹主动脉血5 mL,4 ℃下以3 000 r/min离心20 min,取上清液,置于-20 ℃冷冻保存。充分暴露大鼠子宫,观察双侧子宫形态后切取其病变较为明显的部分组织,置于10%甲醛溶液进行固定,用于光学显微镜下观察。将剩余组织冻存于-80 ℃冰箱,用于Western blot检测。

1.6 HE染色观察子宫组织病理学变化 取出已固定好的组织切成合适大小,行脱水透明处理;次日将完成透明的组织进行浸蜡、包埋、切片(切片厚度为3 μm)、烤片;将切片再次脱蜡、脱水,分别进行苏木素和伊红染色,中性树胶封片后在光学显微镜下观察。

1.7 ELISA法检测大鼠血清PGF2α和PGE2含量 按照ELISA测定试剂盒说明书检测大鼠血清PGF2α和PGE2含量。从冰箱中取出试剂盒及样本后,置于室温(25 ℃～28 ℃)平衡120 min,设置标准品孔、样本孔和空白孔,标准品孔各加入不同浓度的标准品50 μL,样本孔先加入样本稀释液40 μL,再加入待测样本10 μL;除空白孔外,在标准品孔和样本孔中加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体(100 μL/孔),用封板膜封住反应孔,放入恒温箱温育60 min。弃去液体,用吸水纸拍干,每孔加满洗涤液,静置20 s,甩去洗涤液,在吸水纸上拍干,如此重复洗板5次。在标准品孔、样本孔、空白孔中加入底物A、B各50 μL/孔,37 ℃避光孵育15 min;在标准品孔、样本孔、空白孔中加入终止液50 μL/孔,15 min内在酶标仪的450 nm波长处测定各孔的A值。以标准品浓度为横坐标,A450值为纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点。通过样品的吸光度值和标准曲线(直线拟合)计算出样品的相应含量。

1.8 Western blot法检测大鼠子宫组织VEGF和MMP2的蛋白表达水平 取子宫组织,经PBS冲洗后置于冰盒,加入200～400 μL高效RIPA组织裂解液,用移液器吹打裂解。使用匀浆机将组织匀浆至非黏稠状,转至EP管,以12 000 r/min离心5 min,取上清蛋白,用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。测定蛋白浓度后将浓度调齐,加入5×蛋白上样缓冲液,100 ℃变性10 min。将变性后的蛋白上样,先用90 V恒压电泳20 min,待溴酚蓝色样本进入分离胶层后,转用120 V恒压电泳70～100 min;使用10%分离胶液以320 mA恒定电流转膜(PVDF膜)70 min,将膜放入封闭液中室温下封闭1.5 h。按相应比例先后在样本中加入一抗、二抗(稀释比例为1 ∶8 000)。一抗孵育:用封闭液(5%脱脂奶粉)稀释一抗,用镊子将膜放入装有一抗稀释液的离心管中进行一抗杂交,注意膜的蛋白面向内,与抗体接触,将离心管放在4 ℃摇床上过夜。二抗孵育:室温下,用TBST在脱色摇床上洗膜3次,15 min/次,用5%的封闭液配置相应种属的二抗,将膜放入二抗中并与二抗接触,放在37 ℃摇床孵育90 min后,在室温环境下用TBST在洗涤摇床上洗膜3次,15 min/次。将膜蛋白面与ECL发光液充分接触后,放入凝胶成像系统中显影、拍照。使用Image J软件分析所得蛋白条带的灰度值并记录。

1.9 统计学分析 使用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 5组大鼠存活情况 模型组有1只大鼠于造模后因感染而死亡,最终纳入9只大鼠。其余各组纳入10大鼠。

2.2 5组大鼠子宫形态学变化 (1)空白组:大鼠子宫形态、大小、色泽、活动度正常,质地较软、结构纹理清晰,与周围组织无粘连,内膜无充血、无水肿及包块形成。(2)模型组:大部分大鼠子宫肿胀、充血、色泽暗红、双侧形态不对称,输卵管迂曲、硬化、增粗,盆腔组织广泛粘连且有积液填充;仅个别大鼠的子宫出现轻度肿胀、有少量积液,双侧输卵管与周围组织轻度粘连。(3)西药组与普针组:两组大鼠子宫组织形态相近,子宫形态皆有一定程度的恢复,质地变软,活动度较空白组差,颜色稍深,宫腔充血、水肿及粘连程度较模型组有明显改善,个别组织内可见少量积液。(4)针法组:与模型组相比,该组大鼠子宫组织色泽变浅,质地变软,活动度基本恢复,宫腔充血和水肿程度明显减轻,输卵管与周围组织间隙清晰。

2.3 5组大鼠组织病理学变化 空白组大鼠子宫组织结构清晰,细胞间质无炎症细胞;可见腺体,子宫无改变;黏膜层结构完整,细胞间联系紧密。模型组大鼠子宫组织结构不清晰,可见大量的炎症细胞,内膜上皮细胞变形、坏死,内膜连贯性中断,间质细胞水肿、出血。与模型组比较,西药组与普针组大鼠子宫组织可见黏膜固有层肿胀,上皮细胞间质增大,但内膜无明显脱落。针法组大鼠子宫组织结构较清晰,可见极少量的炎症细胞,可见腺体。见图1。

图1 5组大鼠子宫组织病理学变化(HE染色,×100)

2.4 5组大鼠血清PGF2α和PGE2含量的比较 与空白组相比,模型组及各干预组大鼠血清PGF2α和PGE2含量均升高(均P<0.05);各干预组大鼠血清PGF2α和PGE2含量均低于模型组,且针法组、西药组大鼠血清PGF2α和PGE2含量均低于普针组(均P<0.05),但针法组与西药组之间差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 5组大鼠血清PGF2α和PGE2含量的比较(x±s,pg/mL)

2.5 5组大鼠子宫组织VEGF和MMP2的蛋白表达水平比较 与空白组相比,模型组及各干预组大鼠子宫组织VEGF、MMP2的蛋白表达水平均升高(均P<0.05);各干预组大鼠子宫组织VEGF、MMP2的蛋白表达水平均低于模型组(均P<0.05);针法组大鼠子宫组织VEGF、MMP2的蛋白表达水平均低于普针组,但与西药组差异无统计学意义(均P<0.05)。见表2及图2。

表2 5组大鼠子宫组织VEGF、MMP2的蛋白表达水平比较(x±s)

3 讨 论

中医学理论认为“久病入络”,其病机为血瘀。SPID的疼痛机理与“血瘀”密切相关,冲任阻滞,胞宫、胞脉失畅,血行不畅,不通则痛,与西医学盆腔炎性疾病的发病机制——血液流变异常、炎症反应有异曲同工之处。《针灸甲乙经》言:“冲脉任脉者,皆起于胞宫,上循脊里,为经络之海。”因此,针刺治疗SPID取穴应从冲、任二脉着手,通调冲任气血。中极穴属任脉,是任脉与足三阴经交会之处,为膀胱的募穴,“极”意味任脉气血在此处达到最高点,为妇科诸病要穴之一,可调和冲任、补益气血;三阴交穴属足太阴脾经,与中极穴同为足三阴经交会穴,具有活血通络、调经止痛的作用,两穴皆主治不孕、带下、月经不调等妇科疾病。有研究表明,针刺中极穴、三阴交穴,可以降低血清炎症因子水平、加速病理产物代谢、缓解疼痛[14]。因此本实验选取中极穴、双侧三阴交穴进行干预。朱琏抑制Ⅱ型针法是基于巴普洛夫神经学说创立的,进针时缓慢捻转并保持平稳,将针由天、人、地三部由浅入深缓慢刺入穴位,通过刺激皮肤表层与深层的神经系统,释放出抑制、修复的神经信号,促使机体恢复正常状态[6]。朱琏认为针刺之所以能治病,主要是由于其可激发和调节机体内部神经系统的调节机能和管制机能,神经系统的机能活动是兴奋和抑制,针灸的刺激主要是对神经系统这两种机能活动的关系进行调整,使之从不正常状态恢复到正常状态[6]。本研究采用朱琏抑制Ⅱ型针法治疗SPID大鼠,结果显示,治疗后大鼠子宫形态接近正常子宫组织,组织结构较清晰,组织的炎症明显减轻,表明朱琏抑制Ⅱ型针法对SPID具有较好的干预效果。朱琏针法治疗SPID具有以下优势:一是针灸通过刺激神经,疏通经络,可调节人体阴阳、气血、脏腑功能,且其能够直达病灶,起效更快;二是针灸通过激发机体自身的调节机能,可促进机体释放内源性物质,发挥防治疾病的效应,且不会产生毒性损害,对人体更加安全;三是朱琏针法以中医学整体观念出发,将人作为一个整体,综合调节全身各系统的功能。此外,虽然目前临床研究提示针灸可以增强免疫、缓解疼痛、消除SPID的炎症[15],但多数治疗方案取穴较多,有潜在风险。而本研究只取中极穴、双侧三阴交穴,可减轻患者心理负担,提高患者的接受度,利于临床的应用推广。

SPID的发病机制复杂多样,其中血清炎症因子水平升高是发病的关键因素。PGF2α参与炎症、癌症、多种心血管疾病的病理过程,其水平升高可以导致子宫平滑肌收缩、局部组织缺血,从而引发疼痛[16]。PGE2是一种血管扩张剂,可刺激细胞增殖、分化及新血管生成,同时也是一种疼痛介质,PGE2的水平升高可以引起神经反应异常,增加痛感[17]。本研究结果显示,模型组大鼠血清PGF2α和PGE2含量高于空白组,而针法组大鼠血清PGF2α和PGE2含量均低于模型组(均P<0.05)。这提示朱琏抑制Ⅱ型针法治疗SPID的机制可能与降低PGF2α、PGE2水平,从而缓解疼痛反应、改善组织血液循环相关。

VEGF是最强大的新生血管因子,其作用是促进血管新生,但 VEGF能使血液中的蛋白等成分排出,因此子宫组织中VEGF过表达会加剧子宫组织的充血和水肿[18]。本研究结果显示,模型组大鼠子宫组织VEGF蛋白表达水平高于空白组,而针法组大鼠子宫组织VEGF蛋白表达水平低于模型组(均P<0.05)。提示朱琏抑制Ⅱ型针法治疗SPID的机制可能为降低VEGF表达,从而抑制内皮细胞增生,降低其通透率,进而减少子宫充血与水肿。MMP2是一种重要的酶,其参与细胞外基质的分解,并在血管生成、细胞凋亡及细胞再生中扮演重要角色,MMP2水平升高对妇科肿瘤的浸润和转移具有较强的判断意义[19]。MMP2的合成增加,可使细胞外基质发生分解,基底膜的保护功能受损、完整性完全丧失,最终导致炎症细胞渗出,不利于炎症的控制[20]。本研究结果显示,模型组大鼠子宫组织MMP2蛋白表达水平高于空白组,而针法组大鼠子宫组织MMP2蛋白表达水平低于模型组(均P<0.05)。说明朱琏抑制Ⅱ型针法可降低MMP2蛋白表达水平,从而抑制炎症物质的分泌,有效促进子宫组织修复。

此外,本研究中,针法组大鼠的子宫形态、组织炎症改善优于西药组及普针组,在降低血清PGF2α和PGE2含量、子宫组织VEGF、MMP2蛋白表达水平方面与西药组相近且优于普针组。普通针刺法通过发挥穴位的主治功能,以达到治疗效果,朱琏针法不仅基于穴位的主治功能,还同时发挥调控神经系统的效应机制,具有较大优势。朱琏抑制Ⅱ型针法与西药的疗效相似,但长期服用大环内酯类抗生素容易引起胃肠道不适、肝损害等不良反应,因而只适用于短期治疗,具有一定的局限性。朱琏抑制Ⅱ型针法发挥效应机制的同时不产生任何毒副作用,可长期应用于SPID的治疗。

综上所述,朱琏抑制Ⅱ型针法可能通过降低血清PGF2α、PGE2含量,抑制VEGF、MMP2蛋白表达来发挥治疗SPID的作用,其效果优于普通针刺法,与西药干预效果相近。本研究结果或可为SPID的临床治疗提供实验基础,对发扬朱琏针灸学术思想和探索SPID的病因及治疗方法具有一定作用。