人参皂苷Rg1 通过Sestrin2 保护心肌细胞的作用

刘 燃，林 志，杨 帆，段继坤

（昆明医科大学第二附属医院心血管内科三病区，云南 昆明 650031）

在心肌缺血后血运重建的过程会引起心肌损伤，这种现象被称为心肌缺血再灌注损伤（myocardial reperfusion injury，MRI）。研究认为氧化应激、钙超载、PH 快速校正、炎症反应、线粒体膜通透性转运孔开放是心肌缺血再灌注损伤的主要发病机制。人参皂苷Rg1（ginsenoside-Rg1，G-Rg1）为四环三萜类衍生物，是人参、三七等人参属药材的主要活性成分之一。以往研究发现，G-Rg1 可抑制钙敏感蛋白和钙调磷酸酶表达，减少细胞内Ca2+超载，缓解心肌细胞肥大及纤维化[1]。G-Rg1 可以抑制心肌细胞凋亡，减少心肌梗死面积[2]。Sestrin2 作为Sestrins 家族蛋白的一员，具有抗氧化应激的作用。研究发现，Sestrin2 可通过激活AMPK 通路，减轻心肌缺血损伤[3]。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）与很多心血管疾病有关。轻度心肌损伤或心肌损伤早期，ERS 可减轻心肌细胞病理应激。然而，过度的 ERS 可导致心肌细胞凋亡[4]。ERS 与Sestrin2 表达调节密切相关，ERS 诱导Sestrin2 表达上调，而Sestrin2 表达可缓解ERS 应激相关性疾病[5]。同时有研究证明血液循环中的Sestrin2水平可在一定范围内表明心血管疾病严重程度或预后[6-8]。

但目前关于ERS 和Sestrin2 在G-Rg1 保护MRI 心肌中的作用，以及ERS 和Sestrin2 相互作用关系，鲜有报道。本研究拟通过模拟大鼠胚胎细胞株（H9C2）的缺血再灌注损伤模型，从分子、细胞层面研究ERS 和Sestrin2 在G-Rg1 缓解MRI 心肌细胞损伤中的作用，及其分子间相互作用关系。

1 材料与方法

1.1 研究材料

1.1.1 主要仪器及试剂Accuri C6 流式细胞仪（美国 BD 公司）；凝胶成像仪（Tanon）、垂直电泳槽（BIO-RAD）；湿式转膜槽，（BIO-RAD）；普通培养箱及三气培养箱（Theromo electron Corporation，美国）；正置荧光显微镜（奥林巴斯 BX53）；大鼠心肌细胞（H9c2 细胞）购买于北纳生物 ；GRg1（sigma 68 317）；活性氧检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；HIF-1α 单抗（bioss bs-20399R）、ATF-6 单抗（bioss bs-1634R）；PERK单抗（bioss bs-2469R）、IRE-1 单抗（abcam ab37073）、Sestrin2 单抗（abcam ab178518）、肌动蛋白单抗（中杉金桥）；HRP 标记通用型二抗（goat 来源，CST）;纯化荧光单抗（Affinuty purified Antibody Daylight 488 Labeled Goat anti-Rabbit IgG（H+L），购自KPL）；Sestrin2 siRNA 转染试剂盒（锐博）;HIF-1α 抑制剂（abcam ab141642）。

1.1.2 Sestrin2 siRNA 转染H9C2 细胞按照转染试剂盒说明书筛选出最佳的siRNA-Sestrin2 序列供后续转染使用。siRNA 转染方法：以riboFECT™ CP 作为转染试剂，转染浓度为50 nM。根据转染试剂盒说明书制备 riboFECT™ CP 混合液。按照分组将制备好的混合液加入6 孔培养板中，酒精喷洒后放入培养箱。48 h 转染完成，可进行后续实验。

1.1.3 实验分组及处理使用10%小牛血清DMEM/F12 高糖培养液培养 H9c2 细胞，以 1×109/L 接种于底面积 25 cm2培养瓶中，将细胞置于37 ℃，5% CO2培养箱中，每隔2 d 传代。当细胞密度达80%～90% 时，随机分5 组。对照组：将高糖培养液置换为无糖无血清培养基继续培养，不作任何处理；缺氧复氧组：无糖无血清培养基培养细胞2 h，除去溶解氧。再将H9C2 细胞置于5%CO2和92% N2、3% O2的培养箱中，在37 ℃下诱导缺氧3 h，持续监测培养箱内氧含量（3% O2），以保持稳定的缺氧水平。最后更换成正常含血清的细胞培养液，在正常培养条件下复氧处理 4 h，构建缺氧复氧心肌细胞损伤模型；G-Rg1 组：用无糖无血清培养基培养细胞2 h，除去溶解氧，而后加入10 µmol/L G-Rg1，最后将H9C2 细胞进行缺氧复氧处理，处理方法同上；HIF-1α 抑制剂组：用无糖无血清培养基培养细胞2 h，除去溶解氧，而后使用10 µmol/L HIF-1α 抑制剂处理细胞 15 min，再加入10 µmol/L G-Rg1，然后进行缺氧复氧处理，处理方法同上；Sestrin siRNA 组：将经过Sestrin siRNA 转染细胞的高糖培养液置换为无糖无血清培养基，而后加入10 µmol/L G-Rg1处理细胞，最后进行缺氧复氧处理。

1.1.4 活性氧ROS 检测方法吸掉培养板中原培养基，加入含有1∶1 000 稀释DCFH-DA 的基础培养基；37 ℃培养箱孵育20 min，用无血清培养基洗涤细胞3 次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。0.25%胰酶消化1～2 min 左右，当发现细胞收缩成球状或呈流沙状时应立即加入0.5 mL 新鲜的完全培养基终止消化；将细胞悬液移至新离心管中，1 000 r/min 离心3 min 收集细胞。流式细胞仪检测细胞ROS 水平。用ROS 阳性细胞所占百分比表示各组心肌细胞中ROS 水平。

1.1.5 蛋白质免疫印迹法提取蛋白质并定量，进行 SDS-PAGE 电泳，而后使用PVDF 膜进行湿转法转膜，完成后将膜置入5%牛血清白蛋白中，室温封闭1 h；TBST 洗膜3 次后加入1∶1 000 稀释的一抗，孵育 12 h ；除去一抗，TBST 洗膜3次后加入1∶2 000 稀释的二抗，室温孵育2 h；除去二抗，TBST 洗膜3 次后进行化学发光、显影、定影。用凝胶成像仪扫描图像，以GAPDH 为内参，使用Image J 软件分析蛋白条带灰度值。

1.1.6 细胞免疫荧光染色PBS 浸洗培养板中已爬好细胞爬片3 次；4%的多聚甲醛室温固定爬片30 min；PBS 漂洗3 次，每次5 min；0.2%Triton X-100 室温通透20 min；PBS 漂洗3 次，每次5 min；用5%羊血清室温封闭 60 mins；除去封闭液，加合适浓度的第一抗体，4 ℃冰箱过夜；PBST 漂洗4 次，每次5 min；加入合适浓度的荧光标记二抗，避光、室温孵育2 h；PBST 避光漂洗4 次，每次5 min；除去多余水滴，每张细胞爬片上滴加50 µl 含DAPI 的抗淬灭封片剂，荧光显微镜下观察并采集图片。

1.2 统计学处理

实验所得数据均采用Prism 8.0 软件进行统计分析。计量资料数据经正态检验均为正态分布（P＞ 0.05），用均数 ± 标准差（）表示，采用单因素方差分析多组间差异。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌细胞中ROS 水平比较

流式细胞术分析显示：与对照组比较，缺氧复氧组细胞内ROS 水平明显上调[（67.73±3.70）%，（89.19±1.44）%，P＜ 0.01]；与缺氧复氧组比较，G-Rg1 组细胞内ROS 水平明显降低[（89.19±1.44）%，（72.64±1.67）%，P＜ 0.01]；与G-Rg1 组比较，HIF-1α 抑制剂组、Sestrin2 siRNA 干扰组心肌细胞内ROS 水平上升[（72.64±1.67）%，（89.69±2.90）%，P＜ 0.01]、[（72.64±1.67）%，（87.75±3.29）%，P＜ 0.01]，见图1。

2.2 各组心肌细胞HIF-1-α、Sestrin2 蛋白表达及内质网跨膜蛋白：ATF-6、PERK、IRE-1 表达的比较

Western blot 检测结果显示，与对照组比较，缺氧复氧组细胞HIF-1α、Sestrin2、ATF-6、PERK、IRE-1 蛋白表达均升高，P＜ 0.05；与缺氧复氧组比较，G-Rg1 组细胞HIF-1α、Sestrin2、ATF-6、PERK、IRE-1 蛋白表达均升高，P＜ 0.05；与G-Rg1组比较，HIF-1α 抑制剂组细胞Sestrin2 蛋白表达明显下调，P＜ 0.05，其余蛋白表达差异无统计学意义；与G-Rg1 组比较，siRNA 干扰组心肌细胞IRE-1 表达明显上调，P＜0.05，其余蛋白表达差异无统计学意义，见图2。

图2 各组心肌细胞 HIF-1α、Sestrin2 蛋白表达及内质网跨膜蛋白：ATF-6、PERK、IRE-1 表达Fig.2 The protein expression of HIF-1α，Sestrin2，ATF-6，PERK，IRE-1 in cardiomyocytes

2.3 免疫荧光检测各组HIF-1-α、Sestrin2 及内质网跨膜蛋白

ATF-6、PERK、IRE-1，检测结果与western blot 检测结果具有一致性，见图3。

3 讨论

已有研究证明G-Rg1 可抑制血管内皮细胞氧化应激、衰老；恢复MRI 心肌细胞中 ATP 的产生，对心血管具有保护作用[9-10]。发生MRI 时，细胞快速产生大量ROS，进而加重损伤。ROS 是MRI 损伤发生的关键因素[11]。

细胞受到外部刺激，如营养不足、缺氧、缺血、氧化应激、DNA 损伤，导致错误折叠蛋白或未折叠蛋白在细胞内质网腔内堆积、钙超载、脂肪代谢异常，内质网平衡稳态遭到破坏，最终引起内质网应激。内质网应激信号转导是通过3 种关键酶介导的：PERK、ATF-6 和IRE1[4]。Joshua J Martindale 等[12]发现，ATF-6 对心肌细胞具有保护作用。ATF-6 可诱导具有细胞保护性的内质网应激蛋白表达，如GRP78 和GRP94。ATF-6 转基因小鼠心肌细胞，在缺血再灌注后具有更好的功能恢复性，同时细胞坏死和凋亡明显减少[12]。Yongxue Ruan 等[13]发现，缺血早期，内质网被激活对心肌细胞具有保护作用，然而到了后期，内质网应激主要引起细胞凋亡。内质网应激发挥不同功能主要取决于ATF-6，PERK 和IRE-1 蛋白活化的程度和内质网应激的性质。

研究发现哺乳动物Sestrins 的亚型分别是Sestrin1、Sestrin2、Sestrin3。Sestrins 可在缺氧、氧化应激、饥饿、DNA 损伤等各种应激条件诱导下表达升高。目前对Sestrin2 的研究最为广泛，Sestrin2 可通过激活AMPK、抑制mTOR 信号通路，诱导细胞自噬，进而减少细胞内ROS 累积，调节细胞内稳态[5]。Yunxia Liu 等[14]发现，Sestrin2 可通过激活AMPK，减少ROS，抑制P38、ERK、JNK 磷酸化，减少缺氧再灌注心脏梗死面积，改善心肌细胞收缩性，保护心肌细胞。Park HW 等研究发现，ERS 与Sestrin2 表达调节密切相关，ERS 诱导Sestrin2 表达上调，而Sestrin2表达可缓解ERS 应激相关性疾病。Sestrin2 主要通过调节AMPK-mTORC1 蛋白信号通路维持内质网应激平衡稳态[15]。Li-Xue Wang 等[16]研究发现，Sestrin2 通过抑制PERK-ATF4-CHOP 信号通路，减少因内质网应激导致的树突状细胞凋亡。然而，Sestrin2 作为反馈调剂因子，缓解内质网应激所致细胞损伤的具体机制，目前仍不清楚。ERS 时活化的IRE-1 具有内切核糖核酸酶的活性，对下游XBP1 mRNA 进行剪接，产生活性转录因子XBP1s，上调内质网相关基因表达。长时间活化IRE-1，可通过活化TRAF2/ASK1/JNK 信号通路，促进细胞凋亡[4]。

当细胞处于缺血缺氧状态时可表达多种基因，其中缺氧诱导因子1α（Hypoxia Inducible Factor-1，HIF-1）可作为重要的转录因子，调节靶基因的表达。HIF-1α 可通过上调一氧化氮合成酶（iNOS）、血红素（HO-1）、环加氧酶2（COX-2）、抗氧化酶缓解心肌细胞缺氧复氧损伤[17]。Essler S 等[18]研究证明HIF-1α 可诱导活化Sestrin2。但是在癌细胞里则出现了不一样的调节关系，Sestrin2 可以通过下调哺乳动物雷帕霉素复合物1（mTORC1）和缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）靶标来强烈抑制致癌信号通路，亦可被缺氧诱导因子-1（HIF-1）转录激活，同时在一定条件下，Sestrin2降低T 细胞和自然杀伤细胞的细胞毒性活性，这有助于肿瘤细胞免疫逃避[19-20]。

本研究通过大鼠胚胎细胞株（H9C2）的缺血再灌注损伤模型，从分子、细胞层面研究在G-Rg1缓解急性心肌MRI 中HIF-1α、ERS 和Sestrin2相互作用关系。本研究发现，与对照组相比，GRg1 处理后，缺氧复氧心肌细胞内ROS 含量明显降低，再次证明，G-Rg1 对缺氧复氧心肌细胞具有保护作用。经G-Rg1 处理的缺氧复氧心肌细胞，HIF-1α、Sestrin2 表达上调。抑制HIF-1α 或沉默Sestrin2 基因，G-Rg1 对ROS 的抑制作用明显减少。因此笔者认为，HIF-1α 和Sestrin2 在GRg1 保护MRI 心肌细胞的相关机制中起关键作用，缓解心肌细胞所受缺氧复氧损伤。同时G-Rg1 可促进缺氧复氧心肌细胞内质网应激，细胞内ATF-6、PERK、IRE-1 表达升高。此外，笔者发现，沉默细胞Sestrin2 基因，G-Rg1 处理的缺氧复氧心肌细胞，IRE-1 表达明显上调，PERK、ATF-6蛋白表达无明显变化，Sestrin2 通过抑制IRE-1过度表达，维持内质网应激平衡稳态，减少由内质网应激引起的心肌细胞凋亡。抑制HIF-1α，G-Rg1 对Sestrin2 的促表达作用受到部分抑制。然而是否沉默Sestrin2 基因，并不影响G-Rg1 对HIF-1α 的作用；抑制HIF-1α 前后，G-Rg1 对ATF-6、PERK、IRE-1 蛋白表达无明显变化。由此我们认为，G-Rg1 可通过HIF-1α 上 调Sestrin2 表达，进而保护心肌细胞。而G-Rg1 能否通过其它信号通路上调Sestrin2 表达目前尚无相关研究证明。

本研究均为体外实验，只涉及一种心肌细胞系，研究具有一定局限性，后续将通过体内实验进一步丰富并完善实验证据。此外，ERS 对HIF-1α 和Sestrin2 的作用及相关机制，仍需后续实验进行深入探究。