大枣多糖提取工艺及抗氧化活性研究

◎ 廉伟伟，王春燕，郑梦寒，吕双双，张会丽

（郑州工业应用技术学院药学与化学工程学院，河南 郑州 451150）

大枣，又被叫做枣子、良枣、刺枣、贯枣、姜枣等，鼠李科植物枣树的成熟果实就是大枣[1]。截至目前,中国的优良枣树品种居世界第一，大多数分布在山西、山东、河北、陕西、新疆和河南等地。

研究表明，红枣含有丰富的维生素P、环磷酸腺苷（cAMP）、维生素C、黄酮类、多糖等[2-3]。其中，大枣多糖具有护肝保肝、抗氧化、提高免疫力、抗炎和抗肿瘤等作用[4-5]。目前，常用的提取方法有水提醇沉法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法和酶提取法[6]等。

大枣多糖具有较强的抗氧化活性，能增强慢性疲劳综合症鼠的免疫系统能力和抗氧化能力，而且可作为生物反应调节物[7]。最近研究[8]表明，大枣多糖可以作为天然抗氧化剂使用，相关学者利用化学及生物学方法对大枣多糖抗氧化活性进行评价，包括多糖清除羟基自由基、抑制脂类过氧化等，证实了大枣中含有的多糖有着良好的抗氧化作用，不仅能作为食品食用，还能作为一种身体的调理剂。因此，大枣作为一种药食两用的绿色产品，在中国拥有广阔的市场。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

大枣，产自河南省新郑市，购买于禹州市信义教学设备有限公司；FW80微型高速万能试样粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）；SH-Z-D（III）循环水式多用真空泵（郑州瑞涵仪器有限公司）；202-2型电热恒温干燥箱（上海椿拉仪器仪表有限公司）；BK-1000B超声波清洗仪（济南巴克超声波科技有限公司）；UV1700PC紫外分光光度计（上海奥析科学有限公司）；N-1300旋转蒸发仪（东京理化）；95%乙醇分析纯（批号20220105，上海展云化工有限公司）。

无水乙醇（批号20220120， 上海展云化工有限公司）；石油醚（批号220220，上海展云化工有限公司）；苯酚（批号220105，上海展云化工有限公司）；无水葡萄糖（＞98%）标准品（批号B21882，上海源叶生物科技有限公司）；抗坏血酸（99.7%）标准品（批号20220223，天津市光复科技发展有限公司）；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基（97%）标准品（批号20220220，上海展云化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大枣多糖提取工艺

称取大枣适量，按条件进行提取，提取液浓缩至1∶2（原料重∶溶液体积），醇沉，静置，离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，经真空干燥，得到粗多糖，接着，计算收率及多糖含量。将大枣去核粉碎，称取大枣粉，水浴回流脱脂后室温干燥，干燥大枣粉浸泡1 h，水浴浸提，抽滤，保存滤液，滤渣加入同样水量，再次浸提，合并两次所得提取液，浓缩至原提取液1/4，用无水乙醇醇沉，使醇浓度达到80%，经过静置、离心、沉淀，用无水乙醇、丙酮和石油醚反复洗涤真空干燥，得到大枣粗多糖。

1.2.2 标准曲线的绘制

首先，将约0.025 0 g的葡萄糖标准品精确称量至25 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解，然后将其稀释至刻度线，以获得浓度为1.024 mg/mL葡萄糖标准溶液。接着，从配制的葡萄糖标准溶液中，依次吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL溶液至10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线。其次，分别取1 mL标准溶液到1、2、3、4、5号试管中，再依次向5支试管中加入5%苯酚溶液1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，再放人沸水煮30 min，30 min后取出，分别从试管中取2 mL样品加入比色皿。最后，取1.0 mL的蒸馏水按上述的实验程序进行操作，并将其用作葡萄糖标准溶液的空白对照，于紫外分光光度计490 nm[9]处测定葡萄糖标准溶液的吸光度（A），绘制标准曲线。

1.2.3 稳定性实验

取浓度为1.024 mg/mL的葡萄糖标准溶液0.5 mL于10 mL容量瓶，用蒸馏水定容至刻度线，并混匀，从中取1 mL标准溶液试管中，再依次向5支试管中加入5%苯酚溶液1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，再放入沸水浴30 min后取出，放冷至室温，从试管中取样品适量加入比色皿中，同法制备空白对照，室温放置0、6、12、18、24 h，测定在490 nm处吸光度。

1.2.4 精密度实验

分别精确吸取六份浓度为1.024 mg/mL的葡萄糖标准溶液0.5 mL，用蒸馏水定容到10 mL容量瓶中，摇匀待用，然后按1.2.6的试验程序进行试验，用苯酚-硫酸法测定吸光度（A）。

1.2.5 重复性实验

精密称定6份脱脂后的大枣粉15 g ，按照1.2.6项下实验过程进行操作，依次制备出6份供试液备用，并按以上方法进行吸光度（A）的测量。

1.2.6 苯酚-硫酸法测定大枣多糖含量

首先用脱脂后的大枣粉15 g（A）进行最佳工艺提取，得到1.7 g（m）大枣粗多糖，其次测定含量,实验步骤如下：

精确称量约0.02 g（B）大枣粗多糖至100 mL容量瓶，用蒸馏水溶解后再定容至刻度线，再取出10 mL到100 mL容量瓶，再用蒸馏水定容到刻度线，然后吸取1.0 mL注入试管中，加入1.0 mL的5%苯酚试剂和5.0 mL浓硫酸，摇匀煮沸30 min。用紫外分光光度计法在490 nm处测量吸光度（A），把A值代入2.1项下线性回归方程中，得到大枣多糖浓度C，按照下列公式（1）计算出大枣粗多糖含量。

D为稀释体积（mL）；

C为大枣多糖浓度（μg/mL）；

A为大枣脱脂后质量（g）；

B为称取的大枣粗多糖质量（g）；

m为最佳工艺提取的粗多糖质量（g）。

1.2.7 DPPH法测定大枣多糖抗氧化活性

精密称定所需试剂1,1-二苯基-2苦肼基自由基（DPPH）约5 mg至100 mL刻度的容量瓶，用无水乙醇溶解稀释至刻度线，充分振摇，制成DPPH乙醇溶液，浓度为0.055 mg/mL。使用紫外分光光度计在517 nm测VC吸光度（A0）。

将约0.02 g VC精确称量到25 mL容量瓶，用无水乙醇溶解，然后稀释到刻度线，充分振摇，然后将VC溶液配制成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL作为阳性对照。

称取大枣粗多糖约0.02 g，制成和VC相同浓度的大枣多糖溶液，先分别吸取1 mL不同浓度的多糖溶液于1、2、3、4、5号试管中，于紫外分光光度计517 nm处测量吸光度（A1），再分别向5支试管加入2 mL的DPPH乙醇溶液，最后分别取5支试管中溶液2 mL于比色皿中，30 min后再次测量吸光度（A2）。按照公式（2）分别计算出大枣多糖对DPPH自由基清除率（%），并绘制不同浓度大枣多糖对DPPH自由基的清除作用曲线。

1.3 统计学处理

通过SPSS软件进行统计学处理，两组间比较采用t检验，以P＜0.05具有统计学含义。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

以苯酚硫酸法在490 nm处测葡萄糖吸光度，如表1所示。以葡萄糖浓度（μg/mL）作为横坐标，吸光度（A）作为纵坐标，并绘制葡萄糖标准曲线，如图1所示，线性回归方程Y=0.006 6X+0.229 5，相关系数为R=0.999 8，具有良好的线性关系。

图1 葡萄糖标准曲线图

表1 葡萄糖标准溶液浓度与吸光度测定数值表

通过重复性稳定性测试，结果葡萄糖标准溶液RSD值为1.08%，供试液在24 h内显色稳定；重复性测试，RSD值为1.05%，重复性好；精密度测试，其RSD值为1.12%，精密度符合要求。

2.2 大枣脱脂、多糖提取工艺筛选

2.2.1 回流脱脂溶剂的选择

95%乙醇脱脂的脱脂率（12.75%）＞石油醚脱脂的脱脂率（1.75%），且差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表2。

表2 不同脱脂溶剂脱脂率表（%）（n=3）

2.2.2 超声辅助脱脂溶剂的选择

因为P＞0.05，说明不同的脱脂溶剂对于脱脂率均不会表现出差异性。所以，在超声辅助脱脂时用95%乙醇或者石油醚脱脂都可以，结果见表3。

表3 不同脱脂溶剂脱脂率表（%）（n=3）

2.2.3 大枣多糖工艺筛选

称取脱脂后的大枣粉15 g，以1∶24的比例加入蒸馏水200 mL，在提取之前浸泡1 h，首先是在88 ℃下进行水浴提取两次，每次2 h，其次是超声提取50 ℃下水浴提取两次，每次30 min，最后浓缩提取液，静置醇沉、干燥得大枣粗多糖，称取其重量并计算大枣粗多糖得率。实验结果表明到95%乙醇回流脱脂后水提平均值（6.35），会明显高于95%乙醇超声脱脂后超声提的平均值（3.45），表明95%乙醇脱脂后水提方法好，粗多糖得率最高，所以选择95%乙醇脱脂后进行水提的方法，结果见表4、图2。

图2 不同提取工艺柱状图

表4 不同提取工艺粗多糖得率表（%）（n=3）

2.3 大枣多糖回流提取单因素实验

在选择大枣粗多糖提取工艺条件时，主要以料液比、时间和温度为考察对象，探讨这三个因素对大枣粗多糖得率的影响。

2.3.1 料液比对大枣粗多糖得率的影响

称取脱脂后的大枣粉15 g，设置大枣多糖提取温度为68 ℃，提取时间为4 h，考察1∶6、1∶12、1∶18、1∶24、1∶30液料比对大枣粗多糖得率的影响，重复3次，进行最佳料液比的筛选。由表5可知，当料液比范围是1∶6~1∶30时，随着水量的增加，大枣粗多糖得率也在逐步提高，尤其当料液比为1∶24时，大枣粗多糖得率最高（如图3所示），所以选择1∶24的料液比。

图3 料液比对大枣提取的影响图

表5 料液比对大枣粗多糖得率的影响数据分析表（n=3）

2.3.2 温度对大枣粗多糖得率的影响

先称取脱脂后的大枣粉15 g，然后以2.3.1中筛选的最佳料液比为条件，时间是4 h，设置温度58 ℃、68 ℃、78 ℃、88 ℃、98 ℃，探究温度对大枣粗多糖得率的影响，重复3次，进行最佳提取温度的筛选。由表6可知，大枣多糖温度范围是58 ℃~98 ℃，随着温度的升高，粗多糖得率呈现一种递增状态；当温度达到88 ℃时，粗多糖得率最高，因此选择提取温度88 ℃（如图4所示）。

图4 提取温度对多糖提取的影响图

表6 提取温度对大枣粗多糖得率的影响数据分析表（n=3）

2.3.3 时间对大枣粗多糖得率的影响

称取脱脂后的大枣粉15 g，以2.3.1和2.3.2筛选的最佳料液比和提取温度为基础，考查不同大枣多糖提取时间1、2、3、4、5 h对大枣粗多糖得率的影响，重复3次，进行最佳时间的筛选。由表7可以看出，大枣多糖提取时间是从1 h~5 h，在此时间内，大枣粗多糖得率是先升高后降低，在2 h时间段粗多糖得率最高，粗多糖得率最高，所以选择2 h的提取时间（如图5所示）。

图5 提取时间对大枣粗多糖得率的影响图

表7 提取时间对大枣粗多糖得率的影响数据分析表（n=3）

表8 正交试验因素水平表

2.4 正交试验优化大枣多糖提取工艺结果

在单因素实验基础上，选取三个考察因素即提取温度、提取时间、料液比，考察不同条件对提取大枣粗多糖得率的影响，为正交试验提供合理提取条件，再在一定料液比（g∶mL）、提取时间（h）、提取温度（℃）下，通过水体醇沉法提取大枣粗多糖，以大枣粗多糖得率为判别指标，设计出正交试验，优化大枣多糖最佳提取工艺，详见表8-10。

从表9可以看出，将三种因素在正交试验表格中的极差（R）进行比较，得到RC＞RA＞RB；影响大枣粗多糖得率的主要因素首先是提取温度，其次是料液比，最后是提取时间；借助表10，确定大枣多糖最佳提取参数为A3、B3、C3，即提取时间2 h、料液比1∶24、提取温度88 ℃。

表9 正交试验因素水平表

表10 正交试验方差分析表

2.5 验证结果

在正交试验优化的最佳提取工艺基础上，取脱脂后大枣粉15 g，以1:24的料液比、4 h的提取时间、88 ℃提取温度，用水提醇沉法分别进行3次实验。最终大枣粗多糖得率为9.60%、9.59%、9.51%，平均得率为9.57%，3次结果相差不大，表明此工艺条件是合理的。

2.6 大枣多糖含量测定

用脱脂后的大枣粉15 g进行水提醇沉，以最佳工艺进行提取，得到1.7 g大枣粗多糖。精确称取约0.02 g粗多糖，按照1.2.6方法处理，进行含量测定，在紫外分光光度计下490 nm处测得的吸光度A为0.374，将其代入线性回归方程Y=0.006 6X+0.229 5，得到大枣粗多糖浓度为21.89 μg/mL,再代入公式（3）得大枣粗多糖含量为116.47 mg/g。

2.7 抗氧化活性测定

以DPPH法，抗坏血酸（Vc）作为对阳性照，结果显示，大枣多糖的浓度与DPPH的清除率有一定的相关性，大枣多糖的浓度在0.2~1.0 mg/mL之间，清除率随着浓度的升高而增大，且呈现剂量-反应关系，大枣多糖浓度为1.0 mg/mL，大枣多糖的清除效率可达90%以上，说明大枣多糖的抗氧化能力很强（如图6所示）。

图6 大枣多糖对DPPH自由基清除活性图

3 讨论

（1）脱脂方法选择：在实验当中，分别采用95%乙醇和石油醚两种脱脂溶剂在不同脱脂条件下进行脱脂，最终选择95%乙醇进行脱脂。（2）提取工艺筛选：在预实验当中，统一条件下，对水提和超声波辅助提取进行比较，其结果表明水提方法好，且粗多糖得率最高。（3）提取工艺优化：在提取工艺的优化实验中，采用料液比、温度、时间三个参数，对大枣多糖提取工艺进行了优化，采用单因素和正交实验法，得出最佳提取工艺参数：料液比为1∶24、提取温度为88 ℃、提取时间为4 h。魏然[10]通过优化得到的热水提取大枣多糖条件，影响多糖提取率的顺序是温度＞时间＞料液比，最优条件为：液料比1∶20、提取温度90 ℃、提取时间5.3 h，得率为5.27%。（4）抗氧化活性：本文经过单因素和正交试验对大枣多糖提取工艺进行了优化，紧接着进行了抗氧化活性研究，得出大枣多糖与活性大小成正比，与李雪华等[11]研究结果一致，都说明了大枣多糖具有较强的抗氧化活性。

4 结语

大枣多糖最佳提取条件为：提取时间4 h，提取温度88 ℃，料液比1∶24，所测的大枣粗多糖含量为116.47 mg/g。本研究结果表明大枣多糖溶液具有清除自由基的能力，证实了大枣多糖是一种很好的体外抗氧化活性成分。