海马注射脑源性神经营养因子对大鼠脑卒中后抑郁的作用及机制

张珍珍，位慧芳，张勇，张辉

作者单位：郑州大学附属郑州中心医院，a神经内科，b神经外科，河南 郑州 450000

脑卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是脑卒中后复杂情感性精神障碍疾病，与海马内脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）表达有关，BDNF 下调可能是引起应激反应中神经元萎缩的重要因素［1-3］。环磷酸腺苷（cyclic AMP，cAMP）/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）/BDNF 通路是抗抑郁的重要通路以及抗抑郁药物治疗发挥作用的重要途径和靶点，但目前其在PSD 中作用机制的研究较少［4］。本研究自2022 年1―3 月通过观察海马区慢病毒载体微注射BDNF 对大鼠PSD 的改善作用，并探讨其对cAMP/CREB/BDNF 通路的影响，旨在为临床治疗PSD提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级SD 雄性大鼠95 只，6 周龄，体质量（180±20）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。置室温（23±2）℃、湿度60%～65%、人工12 h 昼/夜照明环境中饲养。本研究中对动物的处置符合动物实验伦理学原则。

1.2 主要试剂cAMP/CREB/BDNF 通路抑制剂SQ22536、激活剂forskolin 购自美国Selleck Chemi⁃cals 公司；兔抗大鼠cAMP、BDNF 单克隆抗体，pCREB 多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 单抗购自美国Abcam 公司；反转录试剂盒、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）和5-羟色胺（5-hy⁃droxytryptamine，5-HT）酶联免疫试剂盒为日本Ta⁃KaRa公司产品。

1.3 方法

1.3.1 造模及分组采用随机数字表法选取80 只大鼠，采用中动脉栓塞法［5］建立脑卒中模型，余15只为假手术组，仅在颈部正中取切口，分离颈总动脉、颈内与颈外动脉，不进行动脉栓塞操作。采用Longa 评分法［6］进行神经功能缺损评分：无缺损0分；右前肢无法完全伸展1 分；行走时向右旋转2分；行走时向右倾斜3 分；不能自发行走，有意识障碍4 分。评分为2~3 分者为建模成功。脑卒中模型制备成功7 d后，参考傅松年等［7］方法给予大鼠慢性不可预见性温和应激，包括夹尾、禁水、禁食、高温、冰水游泳、昼夜颠倒和水平摇晃7 种刺激，每天1 种刺激，重复3 周。期间所有大鼠孤养，制备PSD 模型。将造模成功的64 只大鼠采用随机数字表法分为PSD 组、无序干扰组、BDNF 组各12 只，激活剂组和抑制剂组各14只。

1.3.2 干预方法各组大鼠以3%（质量浓度）戊巴比妥钠按体质量40 mg/kg 腹腔注射麻醉，采用脑立体定位仪固定大鼠，于前囟后0.8 mm，右侧旁1.6 mm 部位钻孔，直径0.5 mm。无序干扰组注射1 µL含无序干扰序列的重组慢病毒载体，BDNF 干预组注射1 µL 含过表达BDNF 的重组慢病毒载体，激活剂组和抑制剂组按体质量10 mg/kg分别皮下注射含5%二甲基亚砜的forskolin 和SQ22536，假手术组和PSD组注射等量含5%二甲基亚砜的生理盐水。

1.3.3 糖水消耗实验和敞箱实验（1）糖水消耗实验：干预结束后，将假手术组、PSD 组、无序干扰组、BDNF 干预组大鼠单笼饲养，实验前48 h 进行糖水适应训练，训练结束，禁食禁水12 h，给每笼大鼠放置1瓶已称重的1%（质量浓度）蔗糖水和纯水，自由饮水2 h，称取瓶子重量计算糖水和纯水消耗量。糖水消耗百分比=糖水消耗量（g）/（糖水消耗量+纯水消耗量）×100%。（2）敞箱实验：将假手术组、PSD 组、无序干扰组、BDNF 组大鼠置体积80 cm×80 cm×40 cm、底面由25 块16 cm×16 cm 的正方形组成的黑箱内适应10 min 后，将其放入正中央格观察其5 min内活动情况，监测指标包括方格间穿行次数（3 只爪以上跨入邻格次数）及竖起修饰次数（前肢离地1 cm以上次数）。

1.3.4 组织取材糖水实验和敞箱实验结束，处死所有大鼠，分离双侧海马组织。各组取7 只大鼠左侧海马组织置4%（质量浓度）甲醛中固定备用，余海马组织置−80 ℃保存备用。

1.3.5 海马BDNF 表达水平检测假手术组、PSD组、无序干扰组、BDNF 组分别取7 只大鼠右侧海马组织，提取总RNA，反转录为cDNA，以GAPDH 为内参基因，进行RT-qPCR 检测BDNF 相对表达水平。引物序列：BDNF：正向：5′-GACAAGGTCAACTG⁃GCCTAC-3′，反向：5′-TCGTCATGACCTCTGAACCT-3′；GAPDH：正向：5′-AGACAGCGAGCATCTTCTT⁃GT-3′，反向：5′-TGATGGCAACGAATGTCCACT-3′。

1.3.6 海马组织病理学观察取假手术组、PSD组、无序干扰组、BDNF 组经4%（质量浓度）甲醛固定的左侧海马组织，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片（片厚4 µm），行常规HE染色。封片后置显微镜下观察。

1.3.7 海马组织NE 和5-HT 水平测定假手术组、PSD 组、无序干扰组、BDNF 组取大鼠左侧海马组织，匀浆，4 ℃下以3 000 r/min离心10 min（离心半径8 cm），取上清，采用全自动酶标仪测定5-HT 及NE 450 nm处的吸光值。

1.3.8 蛋白质印迹法（Western blotting）各组取剩余大鼠右侧海马组织，提取总蛋白，采用BCA 试剂盒定量，95 ℃水浴使蛋白变性，进行SDS-PAGE凝胶电泳。以β-actin 为内参，计算各蛋白条带灰度值/β-actin 蛋白条带灰度值表示cAMP、pCREB、BDNF蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法采用SPSS 25.0 软件分析，计量资料以表示，经Levene 与方差齐性检验，方差齐，多样本数据进行单因素方差分析，多组间两两比较采取SNK-q检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖水消耗实验和敞箱实验与假手术组比较，PSD 组大鼠糖水消耗量、方格穿行次数和竖起修饰次数减少（均P<0.001）；与PSD 组比较，BDNF 组大鼠糖水消耗量较大，方格穿行次数和竖起修饰次数较少（均P<0.001），无序干扰组与之差异无统计学意义（P=0.871、0.470、0.072）。见表1。

表1 各组大鼠糖水消耗实验和敞箱实验结果比较/

表1 各组大鼠糖水消耗实验和敞箱实验结果比较/

注：PSD为脑卒中后抑郁，BDNF为脑源性神经营养因子。①与假手术组比较，P<0.05。②与PSD组比较，P<0.05。③与无序干扰组比较，P<0.05。

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2.2 海马组织BDNF 相对表达水平与假手术组（2.62±0.32）比较，PSD 组BDNF 相对表达量（0.62±0.13）降低（P<0.001）；与PSD 组比较，BDNF组BDNF相对表达量（1.68±0.16）升高（P<0.001），与无序干扰组（0.69±0.09）比较，差异无统计学意义（P=0.139）。

2.3 海马组织病理学变化HE 染色结果显示，假手术组海马神经元细胞排列紧密，形态规则；PSD组和无序干扰组海马神经元细胞病理形态相似，细胞数目减少，排列紊乱，形态不规则，部分细胞出现空泡；BDNF 组海马神经元细胞数目增加，排列基本紧密，形态基本规则。见图1。

2.4 大鼠海马组织NE 和5-HT 含量与假手术组比较，PSD 组大鼠海马组织NE 和5-HT 含量降低（均P<0.001）；与PSD组比较，BDNF组大鼠海马组织NE和5-HT 含量较高（均P<0.001），无序干扰组与之差异无统计学意义（P=0.460、0.662）。见表2。

表2 各组大鼠海马组织NE和5-HT含量比较/（ng/g，）

表2 各组大鼠海马组织NE和5-HT含量比较/（ng/g，）

注：NE 为去甲肾上腺素，5-HT 为5-羟色胺，PSD 为脑卒中后抑郁，BDNF为脑源性神经营养因子。①与假手术组比较，P<0.05。②与PSD组比较，P<0.05。③与无序干扰组比较，P<0.05。

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2.5 cAMP/CREB/BDNF 通路在PSD 中的作用与假手术组比较，PSD 组海马区cAMP、pCREB、BDNF 蛋白相对表达量降低（均P<0.001）；与PSD 组比较，BDNF 组、激活剂组海马区cAMP、pCREB、BDNF 蛋白相对表达量升高，抑制剂组海马区cAMP、pCREB、BDNF 蛋白相对表达量降低（均P<0.001），无序干扰组、抑制剂组与之比较差异无统计学意义（P=0.475、0.508、0.876）。见表3，图2。

图2 cAMP、pCREB、BDNF蛋白相对表达量

表3 cAMP、pCREB、BDNF蛋白相对表达量/

表3 cAMP、pCREB、BDNF蛋白相对表达量/

注：cAMP 为环磷酸腺苷，CREB 为环磷酸腺苷反应元件结合蛋白，BDNF为脑源性神经营养因子，PSD为脑卒中后抑郁。①与假手术组比较，P<0.05。②与PSD组比较，P<0.05。③与无序干扰组比较，P<0.05。

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3 讨论

PSD发病机制可能与一些神经递质的分泌失衡有关。研究［8-9］发现，BDNF 可能通过促胆碱能神经生长调控海马学习与记忆功能，在抑郁相关的海马神经突触调控中发挥重要作用。“神经营养因子假说”认为人类的抑郁障碍与脑部BDNF 表达降低及功能下调有关［10］。研究［11-13］发现，抗抑郁治疗能提高患者血清BDNF 水平，提示病人BDNF 水平升高可能改善患者的抑郁状态。故本研究选用BDNF 作为实验药物，分析其对PSD 症状及病理的影响，为PSD临床治疗提供借鉴。

目前，PSD 大鼠主要通过Longa 评分法量化其神经功能缺陷，本研究利用Longa 评分法确定PSD大鼠造模成功。PSD主要表现为活动、不思饮食、体质量下降等，结果显示：与假手术组比较，PSD 大鼠糖水消耗量、方格穿行次数和竖起修饰次数减少，提示PSD 大鼠活动减少，且存在神经功能缺损表现，符合PSD 症状表现。与PSD 大鼠比较，BDNF 组大鼠糖水消耗量、方格穿行次数和竖起修饰次数增加，提示BDNF 可改善PSD 大鼠活动状态以及神经功能。研究发现，PSD 患者海马状突起较健康人变小，神经元萎缩或神经胶质细胞数目减少。本研究通过检测海马BDNF 表达水平结合海马HE 染色发现：与假手术组比较，PSD组海马神经元细胞病理形态相似，细胞数目减少，排列紊乱，形态不规则，部分细胞出现空泡，而BDNF 组较PSD 组明显改善，外源BDNF 干预可作用于海马区，并保护神经元，阻止神经元萎缩与神经胶质细胞数量减少等现象，这可能是BDNF 改善PSD 大鼠神经功能的原因之一［14］。鲍善娟、邵蓓［15］通过电刺激联合舍曲林治疗PSD，发现治疗后5-HT和NE水平显著提高。NE、5-HT能神经元位于脑干，卒中后导致脑梗死缺血或脑出血，在病灶处形成缺氧缺血-脑水肿恶性循环，导致局部血管活性物质释放，促进脑组织变性坏死，影响前述神经元及其通路，导致相应神经递质水平下降，引起抑郁。5-HT 和NE 含量下降可引起失眠、情绪淡漠、空虚、焦虑等抑郁症状，故改善5-HT 和NE 水平是治疗PSD 的关键。本研究中与PSD 组比较，BDNF 组NE、5-HT 含量明显升高，提示海马区注射BDNF对PSD有改善作用。

cAMP/CREB/BDNF 信号通路是调节抑郁症海马神经元再生的关键通路之一［16］。抗抑郁药主要通过提高cAMP浓度，导致cAMP信号级联及其下游靶标pCREB、BDNF 等发生变化，从而发挥抗抑郁作用［17］。抗抑郁药首先激活腺苷酸环化酶，催化ATP脱去一个焦磷酸而产生cAMP，接着cAMP 激活蛋白激酶A 使其下游靶标CREB 在133 位上的丝氨酸发生磷酸化，CREB磷酸化促进其下游靶基因BDNF的表达［18-20］。表3 显示与PSD 组比较，BDNF 组和激活剂组cAMP、pCREB、BDNF 蛋白相对表达水平较高，而抑制剂组与PSD 组比较差异无统计学意义，提示BDNF可能是通过激活cAMP/CREB/BDNF 信号通路改善PSD大鼠症状与病理的。

综上所述，海马内注射BDNF 对PSD 有改善作用，可能是通过激活cAMP/CREB/BDNF 信号通路发挥作用的，为PSD临床治疗提供一定的理论依据。

（本文图1见插图8-2）