温脾养胃颗粒中黄芪甲苷和芍药苷含量测定方法及其应用

2023-07-14高溶溶孙福友李艳丽顾雪晶李秋实陈大全

烟台大学学报（自然科学与工程版） 2023年3期

高溶溶,王磊,孙福友,李艳丽,顾雪晶,李秋实,陈大全,许卉

(1.烟台大学药学院,山东烟台 264005;2.烟台市食品药品检验检测中心,山东烟台 264003;3.烟台市牟平区中医医院,山东烟台 264100;4.滨州市中医医院,山东滨州 256601)

温脾养胃颗粒具有温脾健胃、理中止痛的功效,临床广泛用于脾胃虚弱诸证,症见胃脘疼痛、嗳气泛酸、食欲不振、大便稀溏、舌苔淡、苔白、脉沉细弱等[1-2]。方中黄芪甘温纯阳、补中益气而壮脾胃,白芍扶脾抑肝、坚木疏土而消郁结,两药补气温中,疏肝郁而振脾阳,共为君药。药典规定,黄芪含量测定的指标成分是黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷,其中黄芪甲苷为评判黄芪质量优劣的标志物,白芍含量测定的指标成分则是芍药苷,故测定黄芪甲苷和芍药苷对温脾养胃颗粒质量标准的建立具有重要意义[3-4]。药典中采用 HPLC-ELSD 联用法测定黄芪甲苷含量[4-6]。ELSD是通用型检测器,对所有物质均有响应,在中药复方复杂样品测定中存在灵敏度低、信号不稳定、专属性差等缺点[7]。芍药苷具有紫外吸收,药典中采用 HPLC-UV 联用法测定其含量,但温脾养胃颗粒成分复杂、干扰成分多,在其芍药苷的含量测定过程中存在分离度差且保留时间较长等缺点,故需对其含量测定方法进一步优化。

UHPLC-MS/MS具有分离效果好、特异性和灵敏度高等优点,是中药复方样品测定中最常用的分析方法[8]。本文建立了适用于温脾养胃颗粒中功效成分黄芪甲苷含量测定的UHPLC-MS/MS方法及芍药苷含量测定的HPLC-UV方法,并以芍药苷含量变化为指标,进行影响因素试验和经典恒温试验,为制定温脾养胃颗粒的贮藏条件和有效期提供依据。

1 材料

1.1 仪器

AB 4500 Otrap质谱联用仪(美国AB Sciex公司);Waters e2695型高效液相色谱仪、2489UV-Vis检测器(沃特世科技(上海)有限公司);AR-1140型电子天平(美国奥豪斯仪器有限公司,读数精度0.01 mg);Vortex Genie 2涡旋混合器(上海精科仪器有限公司);SK250HP型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司);TGL-20W型台式高速冷冻离心机(上海湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.2 药物与试剂

黄芪甲苷对照品(批号:2128625,质量分数96.8%)、芍药苷对照品(批号:111610-201908,质量分数94.6%),均购自中国食品药品检定研究院;温脾养胃颗粒(批号:20210329,20210330,20210331)、缺味(黄芪)阴性制剂(批号:20210329-0)、缺味(白芍)阴性制剂(批号:20210329-0),均为实验室自制,规格为每袋净重10 g;甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯,其余试剂均为分析纯,纯净水(娃哈哈集团有限公司)。

2 方法

2.1 黄芪甲苷含量测定的UHPLC-MS/MS方法

2.1.1 色谱条件色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相:0.1%甲酸溶液-乙腈(68∶32);流速:0.3 mL/min;柱温:40 ℃;进样量:2 μL。

2.1.2 质谱条件离子源:电喷雾电离源(ESI),正离子模式;气帘气压力:20 psi;喷撞气:Medium;离子化电压:5500 V;加热器温度:400 ℃;喷雾气压力:55 psi;辅助气压力:50 psi;多反应监测(MRM)的定量离子对:m/z758.4→143.108(黄芪甲苷);碰撞能(CE):12 eV;去簇电压(DP)为14 V。

2.1.3 对照品溶液的制备取黄芪甲苷对照品适量,精密称定,加80%甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,即得。

2.1.4 供试品溶液的制备取温脾养胃颗粒粉末(过四号筛)约2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入含4%浓氨试液的80%甲醇溶液50 mL,密塞,称定重量,加热回流1 h,放冷,再称定重量,用含4%浓氨试液的80%甲醇溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25 mL,蒸干,残渣用80%甲醇溶解,转移至5 mL量瓶中,加80%甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.1.5 阴性对照溶液的制备取制剂处方下相同条件制备的缺味(黄芪)阴性制剂样品,按“2.1.4”项下方法同法制备阴性对照溶液。

2.2 芍药苷含量测定的HPLC-UV方法

2.2.1 色谱条件色谱柱:Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:0.1%甲酸溶液-乙腈(85∶15);流速:1.0 mL/min;检测波长:230 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备取芍药苷对照品适量,精密称定,加20%甲醇溶解,制成每1 mL含40 μg的溶液,即得。

2.2.3 供试品溶液的制备取温脾养胃颗粒粉末(过四号筛)约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入20%甲醇溶液25 mL,密塞,称定重量,超声处理30 min,放冷,再称定重量,用20%甲醇溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备取制剂处方下相同条件制备的缺味(白芍)阴性制剂样品,按“2.2.3”项下方法同法制备阴性对照溶液。

2.3 影响因素试验方法

由于温脾养胃颗粒为易吸湿的水溶性药物,储存不当可能严重影响其稳定性,所以进行高温、高湿、强光条件下的影响因素试验,为确定包装和贮藏条件提供依据[9-10]。

2.3.1 高温试验取温脾养胃颗粒1袋,除去外包装,置洁净培养皿中(厚度<3 mm),置WD-A稳定性检查仪中在60 ℃下放置10 d,于第0、5、10天末取样,按稳定性重点考察项目进行检测。

2.3.2 高湿试验取温脾养胃颗粒1袋,除去外包装,置洁净培养皿中(厚度<3 mm),置WD-A稳定性检查仪中在温度25 ℃、相对湿度90%±5%下放置10 d,于第5、10天末取样,按稳定性重点考察项目进行检测,同时准确称量试验前后供试品的重量,以考察供试品的吸湿潮解性能。于第5天准确称量试验前后供试品的重量,发现吸湿增重大于5%,则在相对湿度75%±5%条件下,同法进行试验。

2.3.3 强光照射试验取温脾养胃颗粒1袋,除去外包装,置洁净培养皿中(厚度<3 mm),置WD-A稳定性检查仪中在照度为4500±500 lx下放置10 d,于第0、5、10天末取样,按稳定性重点考察项目进行检测。

2.4 经典恒温试验方法

经典恒温法是测定药物稳定性的一种常规试验方法,对水溶性药物制剂的研究效果显著[11-12]。其原理是根据化学动力学,将样品存放至不同温度的恒温器中,定时取样并测定其含量,对各温度下不同时间药物进行含量测定。所得结果经处理,即可推算出样品在25 ℃下分解10%所需时间,该时间即为药物的有效期。取温脾养胃颗粒24份,每份约2 g,置带盖恒重瓶中,密封,分为4组,每组6份,分别放入60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃恒温干燥箱中,按图3中各温度下的时间顺序依次取样,迅速冷却,用研钵研成细粉,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,测定芍药苷的含量。

3 结果

3.1 黄芪甲苷含量测定的UHPLC-MS/MS方法学验证

3.1.1 专属性试验依据“2.1”项下色谱及质谱条件,分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各2 μL测定,得典型质谱图如图1所示。由图1可以看出,在与对照品溶液色谱图相应保留时间处,供试品溶液有黄芪甲苷特征吸收峰,而阴性对照溶液无相应吸收峰,表明方法专属性良好。

图1 典型UHPLC-MS/MS图谱

3.1.2 线性与范围取“2.1.3”项下的对照品溶液适量,用80%甲醇分别配制成含黄芪甲苷浓度为1、5、10、20、40和60 μg·mL-1的系列对照品溶液。按“2.1”项下色谱及质谱方法,依次注入超高液相色谱-质谱联用仪,测定峰面积。以对照品质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归,典型回归方程为:y=2.144 3×105x+28 440(r=0.999 8)。结果表明,黄芪甲苷在1～60 μg/mL内线性关系良好。

3.1.3 精密度试验取同一份对照品溶液,按“2.1”项下色谱及质谱条件平行进样6次,记录峰面积。测得黄芪甲苷峰面积的RSD值为1.10%,表明仪器精密度良好。

3.1.4 重复性试验取同一批样品,按“2.1.4”项下方法平行制备6 份供试品溶液,进样测定,结果黄芪甲苷的平均含量为24.91 μg/mL,RSD为1.37%,说明方法重复性可靠。

3.1.5 稳定性试验取同一份供试品溶液,室温下放置,分别于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”项下色谱及质谱条件进样测定,记录峰面积。结果,黄芪甲苷含量的RSD为1.99%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.1.6 加样回收试验取已知含量的同一批样品9份,每份约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,根据供试品中待测量与对照品加入质量之比1∶0.8、1∶1、1∶1.2三种比例,分别加入黄芪甲苷对照品溶液,按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液,再按“2.1”项下色谱及质谱条件进样测定,测得黄芪甲苷的平均回收率为99.64%(RSD=0.89%,n=9),表明方法准确度良好。

3.2 样品中黄芪甲苷的含量测定

取3批温脾养胃颗粒,按“2.1.4”项下方法平行制备3份供试品溶液,再按“2.1”项下色谱及质谱条件进样测定,测得温脾养胃颗粒制剂中黄芪甲苷含量为0.124、0.126、0.127 mg/g(RSD=1.22%),平均值为0.126 mg/g。

3.3 芍药苷含量测定的HPLC-UV方法学验证

3.3.1 专属性试验依据“2.2.1”项下色谱条件,分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL测定,得典型色谱图如图2所示。由图2可以看出,在与对照品溶液色谱图相应保留时间处,供试品溶液有芍药苷特征吸收峰,而阴性对照溶液无相应吸收峰,表明专属性良好。

图2 典型HPLC图谱

3.3.2 线性与范围取芍药苷对照品适量,精密称定,加20%甲醇溶解,制成每1 mL含1 mg的溶液,用20%甲醇分别配制成含芍药苷浓度为10、20、40、60、75和100 μg·mL-1的系列对照品溶液。按“2.2.1”项下色谱方法,依次注入高效液相色谱仪,测定峰面积。以对照品质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归,典型回归方程为:y=1.601 8×104x-34 806(r=0.999 6)。结果表明,芍药苷对照品在10～100 μg/mL内线性关系良好。

3.3.3 精密度试验取同一份对照品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件平行进样6次,记录峰面积。测得芍药苷峰面积的RSD值为1.56%,表明仪器精密度良好。

3.3.4 重复性试验取同一批样品,按“2.2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液,进样测定,结果芍药苷的平均含量为40.80 μg/mL,RSD为1.09%,说明方法重复性可靠。

3.3.5 稳定性试验取同一份供试品溶液,室温下放置,分别于0、2、4、8、12、24 h按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积。结果,芍药苷含量的RSD为1.80%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.3.6 加样回收试验取已知含量的同一批样品9份,每份约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,根据所取供试品中待测定量与对照品加入质量之比1∶0.8、1∶1、1∶1.2三种比例,分别加入芍药苷对照品溶液,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,测得芍药苷的平均回收率为99.86%(RSD=0.95%,n=9),表明方法准确度良好。

3.4 样品中芍药苷的含量测定

取3批温脾养胃颗粒,按“2.2.3”项下方法平行制备3份供试品溶液,再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,测得3批温脾养胃颗粒制剂中芍药苷含量分别为1.02、1.02、1.03 mg/g(RSD=0.56%),平均值为1.02 mg/g。

3.5 影响因素试验结果

高温、高湿、强光照射试验结果见表1。结果表明,样品在高温及强光条件下放置10 d,稳定性重点考察项目均无明显变化,说明本颗粒剂在高温及强光条件下基本稳定;样品在相对湿度90%±5%下放置5 d,颗粒吸潮软化,吸湿增重大于5%,重新在相对湿度75%±5%下放置10 d,颗粒略有结块,说明本颗粒剂对湿度较为敏感。因此,生产应控制在较低湿度下进行,严格密封且置阴凉干燥处保存[13]。

表1 影响因素试验结果

表1(续)

3.6 经典恒温试验结果

3.6.1 不同温度下的样品中芍药苷含量及降解反应速率常数k不同温度下放置的样品芍药苷含量测定结果见图3。分别以各个温度下的lgρ对t进行线性拟合,得各温度下的回归方程,线性关系显著,说明芍药苷的降解符合一级动力学方程。再由回归方程斜率a求出各温度下k值,k=-2.303a,结果见表2。

图3 温脾养胃颗粒中芍药苷在不同温度下的分解数据

表2 温脾养胃颗粒中芍药苷在各试验温度下的回归方程和反应速率常数

3.6.2 制剂有效期预测根据Arrhenius定律:lgk=-E/2.303RT+lgA,以lgk对1/T做线性回归,得回归方程:lgk=-4 442.22/T+9.86(r=-0.995 8,n=6)。根据回归方程,计算得室温(25 ℃)下的反应速度常数k25=8.978 4×10-6,带入公式t0.9=0.105 4/k25=11 739 h=489 d=1.3年。

由E=-2.303Ra计算温脾养胃颗粒中芍药苷的分解活化能,在E=85.06 kJ·mol-1,在41.84～125.52 kJ·mol-1范围内,因此,能够应用Arrhenius指数定律的经典恒温法[14]。

4 讨论

本研究以黄芪甲苷和芍药苷的含量为指标对温脾养胃颗粒进行质量控制,并以芍药苷含量变化为指标进行影响因素试验和经典恒温试验以确定制剂的贮藏条件并预测其有效期。

HPLC-ELSD 联用是目前中药复方中测定黄芪甲苷含量的主要方法[15-16],但ELSD是通用型检测器,具有对所有物质均有响应的特点,使其在中药复方样品测定中具有一定的局限性。温脾养胃颗粒是由16味中药制成的复方制剂,成分复杂、干扰成分多,无法用ELSD实现准确定量。UHPLC-MS/MS联用是将离子按质荷比分离后进行检测的方法,具有灵敏度高、选择性强、准确性好等特点,可用于温脾养胃颗粒中黄芪甲苷含量测定。

本研究所建立的适用于温脾养胃颗粒中芍药苷的HPLC-UV方法,在流动相中选择加入0.1%甲酸使样品中含有活泼氢的易解离组分分离效果更好,不拖尾,优化峰形;在保证系统适用性的前提下,优化流动相比例使芍药苷的保留时间明显缩短,为后续以芍药苷含量测定为应用的稳定性研究以及温脾养胃颗粒作为院内制剂上市后的质量控制缩短了检测时间、节约了检测成本。将该测定方法应用到影响因素试验和经典恒温试验中,为温脾养胃颗粒的贮藏条件及有效期提供了依据,大大缩短了温脾养胃颗粒作为院内制剂的申报审批时间,加快了其上市的进程,更好地满足人民群众的用药需求。