不同制备方法对美洛昔康纳米混悬剂性质的影响

王琳琳,吕亚男,李增敬,崔林涵,杨 芸,梁荣财,王爱萍

(1.山东绿叶制药有限公司长效和靶向制剂国家重点实验室,山东 烟台 264003;2.烟台大学药学院,分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心,山东 烟台 264005)

纳米药物传递系统对难溶性药物体内递送起到了至关重要的作用。纳米混悬剂是由药物和少量稳定剂组成的纯药物粒子分散在水溶液中的亚微米胶体分散体系,不需要载体材料,制备工艺简单,载药量高[2]。纳米混悬剂在满足体内释药行为的基础上,应具有适当的粒度与粒度分布,以减小粒子的沉降速度,从而使混悬剂处于稳定状态。目前纳米混悬剂的制备方法主要有Top-down(分散法)和Bottom-up(凝聚法)两种[2]。Top-down是在稳定剂的存在下,将较大粒度的原料药分散成小颗粒的药物形式,主要方法有介质研磨法、高压均质法等。Bottom-up是将药物溶解在适当的良溶剂中,然后通过溶液中的药物在反溶剂中沉淀形成小颗粒的药物形式。一般将良溶剂为有机溶剂、不良溶剂为水相制备纳米混悬剂的方法称为反溶剂沉淀法;而对于弱酸或者弱碱性药物则可通过调节药液的pH值来制备纳米混悬剂,称为pH沉淀法[3]。Top-down的优点在于任何疏水性药物均可以采用该方法进行制备,但高压均质法能耗较大,介质研磨法可能存在研磨介质残留在混悬液中的问题。Bottom-up的优点在于制备工艺简单,但可能存在有机溶剂残留或者混悬液过酸或过碱的现象[4]。

美洛昔康(MLX)是一种非甾体抗炎药,属于BCS II类药物,适用于类风湿性关节炎、疼痛性骨关节炎和术后疼痛等方面的治疗[5],其中在术后疼痛方面,由于口服吸收起效慢,限制了其在术后急性疼痛领域的应用。为提高药物溶出速率和生物利用度,研究者将难溶性药物制备成纳米尺寸的中间体或最终制剂,用于口服或其他给药途径,有望实现溶出速率和生物利用度的提高[6]。MLX溶于DMSO、DMF等有机溶剂,且为弱酸性药物,溶解度随溶液pH值的升高而增加。本研究根据前期处方研究结果,使用0.5%胆酸钠和0.5%吐温20为稳定剂[7],分别采用介质研磨法、反溶剂沉淀法以及pH沉淀法制备美洛昔康纳米混悬液(MLX-NS),考察三种方法对MLX-NS粒度、形貌、晶型、体外释放度以及稳定性的影响,筛选最优的MLX-NS制备方法,为MLX纳米混悬剂的开发提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器

DYNO-MILL球磨机(瑞士WEB公司);PE20K puls pH计(瑞士Mettler Toledo公司);1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);T25 高剪切分散乳化机(德国IKA公司);3000型激光粒度仪(英国Mastersizer公司); XPE205型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司);DSC822e型差式扫描量热仪(瑞士Mattler Toledo公司);MIX control 20多点磁力搅拌器(德国2mag公司);2.5L型冻干机(美国Labconco公司);D2 PHASER型X射线衍射仪(德国Bruker公司)。

1.2 试药与试剂

美洛昔康(190606,纯度为99.8%,江苏飞马药业有限公司);氢氧化钠(湖南尔康药业股份有限公司);浓盐酸(昆山金城试剂有限公司);DMSO(aladdin);胆酸钠(上海麦克林生化科技有限公司);吐温20(国药集团化学试剂有限公司);乙酸铵(天津市恒兴化学试剂制造有限公司);甲醇(色谱纯,德国Merck KGaA公司)。

1.3 HPLC色谱条件

采用Aglient-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm) 色谱柱,以甲醇- 0.2 mol/L乙酸铵水溶液(50:50)为流动相,进样量为10 μL,柱温为37 ℃,流速为1 mL/min,检测波长为360 nm。

1.4 MLX-NS的制备

1.4.1 介质研磨法 将适量MLX原料预先分散在0.5 %胆酸钠和0.5%吐温20的水溶液中搅拌30 min,制得1%的MLX初混悬液。在研磨腔中填装80%的0.4 mm氧化锆研磨珠。开启研磨机,调整研磨机转速为1500 r/min,通过控制冷却水温度,使研磨温度保持在30 ℃以下。药物混悬液被泵入研磨室,经过研磨珠研磨一定时间后停止研磨,即得介质研磨法制备的MLX-NS。

1.4.2 反溶剂沉淀法 将适量MLX原料溶解于DMSO中(MLX为4%)作为有机相;称取稳定剂(0.1 g吐温20和0.1 g胆酸钠)溶于适量蒸馏水中作为水相,有机相和水相按1:6比例,在13 000 r/min高速剪切作用下,将有机相加入到水相中,并继续剪切2 min,即得反溶剂沉淀法制备的MLX-NS。

1.4.3 pH沉淀法 将0.3 g MLX原料、稳定剂(0.1 g吐温20和0.1 g胆酸钠)溶解于适量 0.1 mol/mL氢氧化钠中(MLX为1.5%),并在13 000 r/min高速剪切作用下将1 mol/L盐酸溶液按1:1比例加入含有药物和稳定剂的碱性溶液中,并继续在13 000 r/min下剪切2 min,即得pH沉淀法制备的MLX-NS。

将三种方法制备的MLX-NS置于室温下保存待用,另分别取少量MLX-NS水洗离心去除辅料后冻干,冻干粉用于形貌和晶型的检测。

1.5 纳米混悬剂的表征

1.5.1 粒度 取适量MLX-NS,以蒸馏水为分散介质稀释至适宜浓度,保持遮光率约为6%,采用马尔文3000型激光粒度仪测定粒度与粒度分布。

1.5.2 形态 取适量MLX-NS冻干粉分散附有导电胶的样品板上,真空喷金后采用扫描电子显微镜观察形貌。

1.5.3 晶型 取适量MLX-NS冻干粉置于样品板中,采用Bruker X射线衍射仪以0.02步长和5 °/min的扫描速度进行测试,记录5～40 °下的衍射图。

取适量MLX-NS冻干粉,放入铝坩埚中,采用差式扫描量热仪以20 ℃/min的升温速率进行测试,记录吸放热曲线。

1.5.4 体外释放度 取0.5 mL MLX-NS于透析袋中(14 KD),以40 mL pH 7.4磷酸盐缓冲液为释放介质,设定恒温振荡器转速为50 r/min,温度为37 ℃。在0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、36、48和72 h分别取样1 mL,同时补加1 mL释放介质,测定并计算美洛昔康的体外累计释放度。

1.5.5 短期稳定性 将MLX-NS室温放置14 d,于0 d、3 d、7 d和14 d测定粒度及粒度分布,考察制剂短期稳定性。

1.6 统计分析

2 实验结果与讨论

2.1 粒度与形貌

采用介质研磨法、反溶剂沉淀法以及pH沉淀法制备的MLX-NS粒度及粒度分布见表1,扫描电镜照片见图1。三种方法制备MLX-NS的d50处于300～600 nm,但介质研磨法的MLX-NS呈不规则颗粒状,棱角分明,粒度分布较宽;而反溶剂沉淀法以及pH沉淀法制备的MLX-NS呈圆润颗粒状,粒度分布较窄。

表1 不同方法制备的MLX-NS的粒度及粒度分布(n=3)

图1 MLX-NS冻干粉的扫描电镜图

2.2 晶型

制备方法可能影响MLX-NS的晶型,将三种方法制备的MLX-NS粉末进行XRD和DSC检测,结果见图2和图3。三种方法制备MLX-NS的DSC图中的吸热峰与MLX相比稍有提前,可能是由于混悬液药物粒子尺寸较小,比表面积大,加热时热量从表面向颗粒内部的传热速率较大,更容易汽化,更早分解能量所致[8-10]。介质研磨法和pH沉淀法制备的MLX-NS与MLX原料的XRD和DSC图峰位几乎一致,表明这两种方法制备的MLX-NS晶型未发生改变;而反溶剂沉淀法制备的MLX-NS与MLX原料的XRD图峰位相差较大,且其DSC图与原料图相比在吸热峰前出现一个明显吸热过程,说明反溶剂沉淀法使MLX-NS发生了转晶[11]。

图2 三种方法制备的MLX-NS冻干粉及MLX的XRD图

图3 三种方法制备的MLX-NS冻干粉及MLX的DSC图

2.3 体外释放

将三种方法制备的MLX-NS和MLX原料进行体外释放度测定(粒度结果见表1),结果见图4。将MLX原料制成MLX-NS后可显著提高体外溶出速率,在2 h时释放超过20%,有望实现在术后镇痛领域快速起效的用途。三种方法制备的MLX-NS中介质研磨法释放较慢,这是由于其粒度较大[12];pH沉淀法制备的药物粒径最小,因此释放快于介质研磨法;而反相沉淀法制备的MLX-NS释放快于pH沉淀法,但反相沉淀法粒度大于pH沉淀法粒度,可能由于反相沉淀法制备的MLX-NS晶型发生改变,导致其溶解度增加,释放加快[13]。

图4 三种方法制备MLX-NS及MLX原料的体外释放度曲线 (n=3)

2.4 短期稳定性

将三种方法制备的MLX-NS常温下放置考察其稳定性,粒度变化情况如图5所示。介质研磨法和反相沉淀法制备的MLX-NS常温放置14 d后,粒径无显著变化,表明其短期稳定性良好。pH沉淀法制备的MLX-NS放置3 d时,粒度显著增加至13 μm,7 d时粒径继续增加至19 μm,这可能是由于pH沉淀法中制剂增大的离子强度影响了胆酸钠的存在状态,从而影响了MLX-NS的等电点,引起MLX-NS的聚集[12]。因此,从短期稳定性角度来看,介质研磨法和反溶剂沉淀法更适用于MLX-NS的制备。

图5 三种方法制备MLX-NS的短期稳定性(n=3)

3 结 论

纳米混悬剂的制备过程受多种因素的影响,在稳定剂种类和浓度相同条件下(0.5 %胆酸钠和0.5 %吐温20),采用介质研磨法、反溶剂沉淀法以及pH沉淀法制备MLX-NS,并对三种方法制备的MLX-NS进行粒度、形貌、XRD、DSC、体外释放及短期稳定性的评价,考察不同制备方法对MLX-NS性质的影响。结果显示三种方法均能制备出d50为300～600 nm的MLX-NS;XRD和DSC谱图显示介质研磨法和pH沉淀法制备的MLX-NS晶型未发生变化,而反溶剂沉淀法制备的MLX-NS晶型发生改变。体外释放度结果显示MLX-NS较原料药可显著提高体外释放速率,且释放速率与粒度及晶型有关;常温放置14 d,介质研磨法和反溶剂沉淀法制备的MLX-NS能保持粒度稳定,而pH沉淀法制备的MLX-NS粒度发生显著增大。研究结果表明,介质研磨法较其他两种方法更适用于MLX-NS的制备,可保持晶型一致和放置稳定性,为MLX纳米混悬剂的研究开发提供依据。