齐墩果酸对糖尿病大鼠视网膜氧化应激反应和视网膜神经节细胞损伤的影响

2023-07-14梁福珍李瀚邦马晓婷胡志娟贾志旸

眼科新进展 2023年7期

梁福珍樊芳毕萌季彤李瀚邦马晓婷刘宇胡志娟贾志旸

糖尿病视网膜病变是糖尿病患者典型的微血管并发症之一。2020年,全球约有1.031亿人患有糖尿病视网膜病变,预计到2045年将增加至1.605亿人[1]。糖尿病视网膜病变现已成为全世界工作年龄人群致盲的首要原因[2]。在长期高血糖状态下,视网膜代谢增加会引起缺血缺氧,加重氧化应激和视网膜神经节细胞(RGC)损伤[3],引起视功能下降[4]。因此,抗氧化应激是延缓糖尿病视网膜病变发展的重要方式之一。

核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)是一种细胞内转录因子,它通过与抗氧化反应元件结合来调控包括血红素加氧酶1(HO-1)在内的多种抗氧化因子的基因表达,激活抗氧化保护系统,减轻氧化应激对细胞和组织的影响[5]。齐墩果酸是一种五环三萜类化合物,以游离和(或)与糖结合成苷的形式广泛存在于植物界,具有保肝、抗糖尿病、抗炎、抗癌等多种药理作用[6-7]。研究表明,齐墩果酸可以增加糖尿病大鼠心肌组织中Nrf2及HO-1蛋白的表达,减轻心肌组织的氧化应激,从而减轻糖尿病大鼠心肌的损伤[8]。本研究探讨齐墩果酸对糖尿病大鼠视网膜氧化应激反应和RGC损伤的影响,为临床防治糖尿病视网膜病变提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组

取6周龄健康清洁级雄性SD大鼠30只,体重180～220 g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物生产许可证号:SCXK(京)2019-0009]。适应性喂养1周后,将30只大鼠随机分为对照组、糖尿病组和齐墩果酸组,每组10只。本研究经河北省人民医院医学伦理委员会审核批准,实验动物的喂养、使用和管理遵循《实验动物管理条例》的规定。

1.1.2 试剂与仪器

鼠维持饲料与45%脂肪供能高脂饲料(北京华阜康生物科技股份有限公司),链脲佐菌素、齐墩果酸(美国Sigma公司),吐温80和BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司),丙二醛(MDA)测定试剂盒与超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所),脑特异性同源盒蛋白3a(Brn-3a)抗体(英国Abcam公司),Nrf2抗体和HO-1抗体(武汉三鹰生物技术有限公司),石蜡切片机、倒置显微镜(德国LEICA公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立

对照组大鼠给予鼠维持饲料喂养,糖尿病组和齐墩果酸组给予高脂饲料喂养。4周后,大鼠禁食12 h,取适量链脲佐菌素溶于0.1 mol·L-1柠檬酸钠缓冲液(pH4.5)中,按照35 mg·kg-1的剂量给予糖尿病组和齐墩果酸组大鼠腹腔内注射链脲佐菌素,对照组注射相应体积的柠檬酸钠缓冲液。次日尾静脉采血,如大鼠空腹血糖≥11.1 mmol·L-1说明造模成功。剔除2只造模失败的大鼠,最终对照组10只大鼠,糖尿病组9只,齐墩果酸组9只。

1.2.2 药物干预及取材处理

将齐墩果酸溶于吐温80,齐墩果酸组大鼠按照100 mg·kg-1剂量每天给予齐墩果酸灌胃;对照组及糖尿病组大鼠每天给予等量的溶剂灌胃。灌胃8周后,腹腔内注射100 g·L-1水合氯醛,过量麻醉处死各组大鼠,迅速摘取双侧眼球。于显微镜下迅速分离左眼视网膜,按19的比例加入磷酸盐缓冲液(PBS),充分研磨制成视网膜匀浆,4 ℃低温离心机3 500 r·min-1离心10 min,取上清液放入-80 ℃保存,用于SOD活性和MDA含量检测,取大鼠右侧眼球迅速放入眼球固定液中,常规石蜡包埋后切片,厚度5 μm,用于HE染色及免疫组织化学染色。

1.2.3 视网膜组织中SOD活性和MDA含量检测

取保存于-80 ℃的视网膜匀浆上清液,严格按照SOD、MDA试剂盒的说明书来测定视网膜组织中的SOD活性和MDA含量。

1.2.4 HE染色观察大鼠视网膜组织形态

切片常规脱蜡至水,PBS洗3次,每次3 min;苏木素染液浸染3 min,自来水冲洗;分化液分化15 s,自来水冲洗返蓝;伊红染液浸染2 min,自来水冲洗;梯度酒精脱水后二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察各组大鼠视网膜组织形态结构变化。

1.2.5 免疫组织化学染色

切片常规脱蜡至水,高压抗原修复;滴加内源性过氧化物酶阻断剂,室温孵育15 min,PBS洗3次,每次3 min;分别滴加一抗Brn3a(1200)、Nrf2(1400)、HO-1(1400),4 ℃孵育过夜,PBS洗3次,每次3 min;滴加二抗,室温孵育1 h,PBS洗3次,每次3 min;DAB显色,苏木素染液复染1 min,自来水冲洗;分化液分化15 s,自来水冲洗返蓝;梯度酒精脱水后二甲苯透明,中性树胶封片后拍照;采用ImageJ软件计算Brn3a染色阳性的RGC密度,测定单位面积内Nrf2及HO-1染色阳性平均光密度(MOD)。

1.3 统计学方法

本研究数据应用SPSS 21.0统计学软件进行分析,数据以均数±标准差表示,采用单因素方差分析和LSD-t检验进行组间比较,检验水准:α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠视网膜组织SOD活性及MDA含量

三组大鼠视网膜组织SOD活性比较,差异有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组大鼠视网膜组织SOD活性低于对照组,齐墩果酸组大鼠视网膜组织SOD活性高于糖尿病组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。三组大鼠视网膜组织MDA含量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组大鼠视网膜组织MDA含量高于对照组,齐墩果酸组大鼠视网膜组织MDA含量低于糖尿病组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠视网膜组织SOD活性、MDA含量及RGC密度

2.2 各组大鼠视网膜组织形态变化对照组大鼠视网膜RGC层、内丛状层、内核层、外丛状层和外核层各层结构清晰,细胞排列整齐、形态正常;与对照组相比,糖尿病组大鼠视网膜变薄,结构疏松,内核层和外核层细胞排列紊乱,外丛状层连续性差;与糖尿病组相比,齐墩果酸组大鼠视网膜结构较清晰,细胞排列较整齐(图1)。

A:对照组;B:糖尿病组;C:齐墩果酸组。GCL:RGC层;IPL:内丛状层;INL:内核层;OPL:外丛状层;ONL:外核层。图1 各组大鼠视网膜组织形态变化

2.3 各组大鼠视网膜组织RGC密度

三组大鼠视网膜组织RGC密度比较,差异有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组大鼠视网膜组织RGC密度小于对照组,齐墩果酸组大鼠视网膜组织RGC密度大于糖尿病组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表1和图2)。

A:对照组;B:糖尿病组;C:齐墩果酸组。白色箭头示RGC;GCL:RGC层;IPL:内丛状层;INL:内核层;OPL:外丛状层;ONL:外核层。图2 各组大鼠视网膜组织免疫组织化学染色结果

2.4 各组大鼠视网膜组织Nrf2和HO-1蛋白表达

各组大鼠视网膜组织各层均有Nrf2、HO-1表达。三组大鼠视网膜组织Nrf2、HO-1染色阳性MOD比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。糖尿病组大鼠视网膜组织Nrf2、HO-1染色阳性MOD均高于对照组,齐墩果酸组Nrf2、HO-1染色阳性MOD均高于糖尿病组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表2)。

表2 各组视网膜组织Nrf2和HO-1蛋白表达情况

3 讨论

糖尿病视网膜病变是糖尿病常见并发症之一,也是导致患者视力受损和失明的主要原因[9]。糖尿病视网膜病变的发病机制目前尚未完全明确。研究表明,糖尿病视网膜病变的发生与氧化应激、炎症、多元醇通路激活、蛋白激酶C激活以及己糖胺途径活化等多种机制相关[10]。其中,氧化应激是由于体内活性氧的产生和清除不平衡而引起的一种状态,已被证实是糖尿病视网膜病变发病的关键因素之一[11]。RGC是一种特殊的投射神经元,位于视网膜内表面附近。研究表明,在糖尿病视网膜病变早期未出现明显血管损伤时,就已出现RGC受损[12],其损伤、变性及凋亡可直接导致视功能的损害[13],减轻氧化应激所致RGC损伤是糖尿病视网膜病变防治的重要靶点。

Nrf2是一种调节氧化应激的重要转录因子,可诱导多种抗氧化基因的表达。在生理状态下,Nrf2与Kelch样ECH关联蛋白1在细胞质中共价结合,当体内氧化应激增强时,关联蛋白1发生构象变化,从而使Nrf2解离并转入核内。在细胞核中,Nrf2与抗氧化反应元件结合,调控其下游抗氧化酶的转录,包括HO-1、醌氧化还原酶1等[14]。HO-1是血红素降解的关键酶,可将血红素降解为胆绿素、一氧化碳和亚铁,共同发挥抗氧化应激、抗炎等作用[15]。齐墩果酸是一种植物界广泛存在的五环三萜类化合物,可以从多种植物及草药中提取出来。它可以通过抑制小肠黏膜刷状缘的α-葡萄糖苷酶活性,延缓碳水化合物吸收,降低餐后高血糖,从而发挥抗糖尿病的作用[16]。有文献报道,齐墩果酸能够激活Nrf2,上调细胞保护基因表达,抑制氧化应激反应[17]。

在本研究中,糖尿病组大鼠视网膜变薄、视网膜各层细胞排列紊乱、RGC密度减少,提示造模成功。SOD活性与MDA含量是常见的氧化应激指标。糖尿病组大鼠视网膜组织中SOD活性降低、MDA含量增加,氧化应激增强,RGC密度减少。同时机体的抗氧化应激机制启动,表现为视网膜Nrf2、HO-1蛋白表达升高,这可能是糖尿病状态下机体的适应性反应。而与糖尿病组相比,齐墩果酸组大鼠视网膜组织中SOD活性升高、MDA含量下降,说明经齐墩果酸治疗后机体的抗氧化能力增强。同时大鼠视网膜组织中Nrf2和HO-1蛋白表达明显升高、RGC密度增加,提示齐墩果酸能够激活Nrf2,上调抗氧化因子HO-1的表达,从而减轻氧化应激损伤,保护受损的RGC。