白介素-10基因启动子rs1800896和rs1800871位点基因多态性与黑衣壮儿童支气管哮喘关系的研究

郑朵 杨丽娟 林娜

【摘要】 目的 探討白介素-10（IL-10）基因启动子rs1800896和rs1800871位点基因多态性与黑衣壮儿童支气管哮喘关系和不同地域种族比较。方法 采用聚合酶链反应和直接测序法，对 156例受试者（黑衣壮哮喘儿童78例和黑衣壮健康儿童78例）IL-10基因启动子rs1800896和rs1800871位点，通过统计学方法分析各基因型及等位基因频率，比较组间差异，并与不同地域种族比较。结果 哮喘组各基因型及等位基因频率与健康组比较差异无统计学意义（P>0.05）。广西黑衣壮儿童各位点基因型和等位基因频率与人类基因组计划公布的非洲尼日利亚人、非洲尼日利亚伊巴丹的鲁巴人、西班牙伊比利亚人、美国休斯敦的古吉拉特印第安人相比差异有统计学意义（P＜0.01），与中国南方汉人相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 IL-10基因位点rs1800896和rs1800871位点的多态性可能与广西黑衣壮族患儿支气管哮喘无相关，与不同种族和地域相关。

【关键词】 支气管哮喘；单核苷酸多态性；白细胞介素10；儿童；种族

中图分类号：R725.6 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.06.007

A study on relationship between polymorphisms at the rs1800896 and rs1800871 loci of interleukin-10 gene promoter and bronchial asthma in black clothed Zhuang children

ZHENG Duo^{1， 2}， YANG Lijuan¹， LIN Na^1▲

（1. Department of Pediatrics， Affiliated Hospital of Youjiang Medical  University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China; 2. Graduate School， Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To investigate relationship between polymorphisms at the rs1800896 and rs1800871 loci of interleukin-10 （IL-10） gene promoter and bronchial asthma in black clothed Zhuang children， and to compare different regions and races. Methods Polymerase chain reaction and direct sequencing were used to analyze the frequencies of the rs1800896 and rs1800871 loci of interleukin-10 gene promoter in 156 subjects （78 black clothed Zhuang children with asthma and 78 healthy black clothed Zhuang children） through statistical methods. And then， difference between groups as well as difference between regions and races were compared. Results There was no statistically significant difference in genotype and allele frequencies between asthma group and healthy group （P>0.05）. The differences between genotype and allele frequencies of Guangxi black clothed Zhuang children at each point and and those of Nigerians of Africa （ESN）， Yoruba people in Ibadan of Nigeria of Africa（YRI）， Iberians in Spain （IBS）， and Gujarat Indians in Houston of America （GIH） announced by the Human Genome Project were statistically significant（P<0.01）. While comparing with those of the  Chinese Han southerner （CHS）， the difference was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion The polymorphisms at the rs1800896 and rs1800871 loci of the IL-10 gene may not be associated with bronchial asthma in black clothed Zhuang children of Guangxi， but they may be associated with different races and regions.

【Key words】 bronchial asthma; single nuleotide polymorphism （SNP）; interleukin-10 （IL-10）; children; race

支气管哮喘是一种以慢性气道炎症和气道高反应性为特征的异质性疾病，以反复发作的喘息咳嗽、气促、胸闷为主要临床表现，常在夜间和（或）凌晨发作或加剧，常伴有可变的呼气性气流受限。研究^［1］发现，遗传方面存在多种基因多态性会影响支气管哮喘的易感性。其中编码白细胞介素-10（IL-10）的基因位于人类基因组的 1 号染色体长臂 （q31-q32），由四个内含子和五个外显子组成，跨度约为 4.7 kb。这是一个与哮喘易感性相关的区域^［2-5］。IL-10启动子区域内存在三种常见的单核苷酸多态性（single nuleotide polymorphism，SNP），包括rs1800896、rs1800871和rs1800872^［4］。与该基因其他多态性的连锁不平衡（LD），能够调节 IL-10的表达，影响其血清学水平，与深静脉血栓形成、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、幽门螺杆菌引起的胃十二指肠疾病和急性胰腺炎、克罗恩病、银屑病及支气管哮喘相关^{［2， 5］}。已证实哮喘发病与SNP相关。然而，未见到IL-10基因多态性与广西地区黑衣壮族支气管哮喘患儿的相关性报道。本研究旨在探讨IL-10基因多态性与黑衣壮族儿童支气管哮喘之间的关系以及与不同种族和地域人种的关系。

1 对象及方法

1.1 研究对象

选取于2021年1月25日至2021年10月28日，就诊于右江民族医学院附属医院儿科门诊及住院部的黑衣壮族支气管哮喘儿童以及同期健康体检的黑衣壮族儿童作为研究对象，从100例支气管哮喘患儿和100例健康体检儿童数据中通过统计学随机数表法，分别随机选取78例，均为广西地区本地人口，祖孙三代及三代以上均为广西黑衣壮族，无血缘关系，无异族通婚史。其中哮喘组78例，男孩57例，女孩21例，最小月龄5个月，最大月龄135个月，平均为（51.0±26.9）个月，均经临床、实验室等检查确诊为支气管哮喘，符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016 年版） 》的诊断标准；正常健康组为78例同期健康体检黑衣壮族儿童，男孩49例，女孩29例，最小月龄15个月，最大月龄111个月，平均为（49.5±22.4）个月。所有患儿家属已签署知情同意书，自愿参与本项目的研究，并经医院伦理委员会批准同意。

1.2 主要的试剂和仪器

PCR仪-A300（杭州朗基科学仪器有限公司）；3730 XL基因测序仪（ABI公司）；Allegra 25R台式高速冷冻离心机（Beckman〔贝克曼〕公司）；Micro 17R微量臺式离心机（Thermo〔赛默〕公司）；微量可调移液器（Eppendorf公司）；Taq DNA ligase（NEB公司）；PCR MIX（上海翊圣生物科技有限公司）；人血液基因组DNA提取试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 采集样本和提取DNA

采集研究对象2 mL外周静脉血，存放于EDTA抗凝管中，采用离心柱型血液基因组DNA提取试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司），提取静脉血中DNA，置于-80 ℃冷冻保存。

1.3.2 设计和合成引物

根据数据库（NCBI）和通过Primer Premier 5软件，委托上海捷瑞生物工程有限公司进行设计和合成引物，IL-10基因rs1800896位点和rs1800871位点引物见表1，引物扩增检测见图1。

1.3.3 检测目的基因分型

采用聚合酶链反应对IL-10基因启动子rs1800896和rs1800871位点进行基因分型。PCR扩增：PCR反应体系采用15 μL，模板DNA 1 μL，引物F 0.3 μL，引物R 0.3 μL，2×PCR MIX 7.5 μL，双蒸水5.9 μL，补至15 μL。PCR反应采用PCR仪-A300，反应条件：PCR反应体系于95 ℃预变性5 min后，按程序94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 90 s，扩增35个循环，最后70 ℃延伸3 min。连接酶检测反应（LDR）：采用反应体系10 μL，PCR产物3 μL，10* Taq DNA ligase 缓冲液（美国NEB公司）1 μL，Taq DNA ligase（40 U/μL）0.125 μL，探针（10 μM） 0.2 μL /条，双蒸水补充至10 μL。循环条件：由94 ℃变性 20 s→58 ℃退火 90 s扩增30个循环。取1 μL产物，加9 μL上样缓冲液，95 ℃变性3 min，立即冰水浴，上测序仪3730 XL进行测序。采用 GeneMarker软件分析模板DNA的SNP。

1.4 不同种族和地域人种基因多态性数据

通过在线 ensemble基因数据库（http：//asia.ensembl.org/index.html），获取千人基因组计划中不同种族和地域人种IL-10基因启动子rs1800896和rs1800871位点的基因多态性分布数据。

1.5 统计学方法

各位点进行Hardy-Weinberg平衡检验验证样本的群体代表性;通过基因计数法直接计算哮喘组和健康组的基因型和等位基因的频率;计数资料的比较采用SPSS 22.0软件进行χ²检验，检验水准：α=0.05;采用单变量logistic回归进一步分析哮喘组和健康组的不同基因位点多态性相对于哮喘的相对危险程度。

2 结果

2.1 群体遗传Hardy-Weinberg 平衡定律检验

经 Hardy-Weinberg平衡检验分析，结果显示：IL-10基因位点rs1800896哮喘组（χ²=0.228，P=0.633），健康组（χ²=0.542，P=0.462）；rs1800871哮喘组（χ²=3.237，P=0.072），健康组（χ²=1.022，P=0.312）；结果表明所选择样本均符合Hardy-Weinberg 平衡定律，且具有群体代表性（P>0.05）。

2.2 IL-10基因rs1800896和rs1800871各位点基因峰型图

rs1800896基因位点分型检测结果检出TT、CT基因型，未检出CC基因型，各基因型峰型图见图2。rs1800871基因位点分型检测结果分别检出AA、GG、AG三种基因型，各基因型峰型图见图3。

2.3 两组IL-10基因位点rs1800896和rs1800871各位点基因型和等位基因频率

对哮喘组和健康组IL-10基因位点rs1800896和rs1800871各位点基因型和等位基因频率进行分析，结果表明：广西黑衣壮族儿童哮喘组IL-10基因位点rs1800896，基因型TT、CT和CC的分布与健康组对比差异无统计学意义（χ²=0.918，P=0.338），且等位基因与健康组相比较，差异也无统计学意义（χ²=0.855，P=0.355）；IL-10基因位点rs1800871，基因型AA、AG和GG的分布与健康组对比差异无统计学意义（χ²=0.891，P=0.640），且等位基因与健康组相比较差异无统计学意义（χ²=0.366，P=0.545）。见表2、表3。

2.4 IL-10基因位点rs1800896和rs1800871各位点多态性对哮喘的相对危险度

IL-10基因位点rs1800896和rs1800871位点多态性对哮喘的相对危险度。单变量logistic回归分析两个位点基因多态性与哮喘的关系，结果显示：rs1800896位点相对于TT基因型而言，CT和CT+CC基因型均不能增加哮喘发生的危险性，OR值（95% CI）分别为0.628（0.242～1.635）、0.667（0.258～1.720）；rs1800871位点相对于AA基因型而言，AG、GG和AG+GG基因型均不能增加哮喘发生的危险性，OR值（95% CI）分别为0.965（0.502～1.856）、0.538（0.144～2.013）、0.900（0.477～1.699）。见表4。

2.5 IL-10基因位点rs1800896和rs1800871各位点基因型及等位基因与不同地区种族人群的比较

结果表明，IL-10基因位点rs1800896的基因型和等位基因频率与ＥＳＮ（非洲尼日利亚人）、YRI（非洲尼日利亚伊巴丹的鲁巴人）、IBS（西班牙伊比利亚人）、GIH（美国休斯敦的古吉拉特印第安人）的基因型和等位基因频率对比差异有统计学意义（P<0.05），与CHS（中国南方汉人）的基因型和等位基因频率对比差异无统计学意义（P>0.05），见表5和表6；IL-10基因位点rs1800871的基因型和等位基因頻率与ESN、YRI、IBS、GIH的基因型和等位基因频率对比差异有统计学意义（P<0.05），与CHS的基因型和等位基因频率对比差异无统计学意义（P>0.05），见表7和表8。

3 讨论

IL-10是一种多效性细胞因子，可以抑制促炎细胞因子的产生，具有抗炎和免疫调节功能，预防过敏性气道高反应性和炎症，通过限制宿主对病原体的免疫反应，进一步防止对宿主造成损害并维持正常的组织稳态，从而在哮喘中发挥保护作用^{［2，3，5，6］}。国外KORPPI等人研究发现，IL-10基因启动子 rs1800896、rs1800871、rs1800872和rs1800890位点的单核苷酸多态性导致6岁之前因支气管炎住院的学龄前儿童免疫力受损，导致后期出现过敏和哮喘的风险增高^［6］。而国内邢飞等人研究发现，IL-10基因启动子rs1800871 位点的单核苷酸多态性可能与安徽皖南地区汉族人群哮喘无关，而与rs1800896和rs1800872位点的单核苷酸多态性相关^［7］。RAEISZADEH JAHROMI等人也发现IL-10基因启动子rs1800896 位点的单核苷酸多态性与轻度哮喘有关^［8］。KOPONEN等人发现IL-10基因启动子rs1800896位点的单核苷酸多态性与0～6 个月曾感染毛细支气管炎的学龄前儿童发生哮喘相关，且rs1800896的等位基因A（野生基因型）是学龄前儿童发生哮喘的危险因素^［9］。 HOLSTER等人研究发现，IL-10基因启动子rs1800896位点变异的等位基因G与等位基因A（野生基因型）相比，于5～7岁和11～13岁持续性哮喘的发病率降低，且吸入性糖皮质激素（ICS）的使用频率减少，认为IL-10基因启动子rs1800896位点的变异等位基因G对哮喘具有保护作用^［10］。IMANI等人分析发现，IL-10基因启动子rs1800896位点的单核苷酸多态性能够降低非洲人群显性模型（GG+GA）和杂合子模型（AG）感染哮喘风险并具有保护作用^［11］。 DASTGHEIB等人经荟萃分析发现，IL-10基因启动子rs1800896位点中等位基因G>等位基因A组与亚洲人和中国人的儿童哮喘显著相关，但与全球人群的儿童哮喘风险无关^［3］。因此，在遗传因素和遗传调节免疫方面显然存在显著的个体差异^［9］。也需要在不同的人群样本中进行更多的遗传关联研究^［2］。我们针对IL-10基因启动子rs1800896和rs1800871位点各基因型和等位基因的分布频率进行统计学分析，然而在哮喘组和健康组间差异无统计学意义；IL-10基因启动子rs1800896和rs1800871位点基因多态性均不能增加哮喘发生的危险性。因此，认为IL-10基因启动子rs1800896和rs1800871位点的多态性可能与广西黑衣壮族患儿支气管哮喘无关。

由于同一基因位点在不同地域人种中的研究结果不相同。因此，进一步研究不同人种及不同地域人群的基因多态性很有必要。通过与ensemble数据库公布的千人基因组计划中的数据进行比较，发现广西壮族儿童IL-10基因启动子rs1800896位点和rs1800871位点各基因型和等位基因分布频率与ＥＳＮ（非洲尼日利亚人）、YRI（非洲尼日利亚伊巴丹的鲁巴人）、IBS（西班牙伊比利亚人）、GIH（美国休斯敦的古吉拉特印第安人）人群相比差异均有统计学意义，而与CHS（中国南方汉人）相比差异无统计学意义。以上结果表明，IL-10基因启动子rs1800896位点和rs1800871位点基因多态性与种族和地域存在密切关系，由于广西黑衣壮族儿童与中国南方汉人的生活环境和地域相似，并同属一个种族，因此基因多态性的差异不大。而广西黑衣壮族儿童与ＥＳＮ、YRI、IBS、GIH生活的地域、饮食和生活习惯均不同，因此基因多态性的差异大。

我們研究了IL-10基因启动子rs1800896和rs1800871位点的多态性各基因型和等位基因分布频率以及与不同种族之间的差异，进一步补充IL-10基因多态性在支气管哮喘中的研究。本研究也存在不足，一方面可能由于黑衣壮族支气管哮喘例数少，容易产生误差。另一方面，未将IL-10基因多态性与临床诊断和治疗联系起来。今后我们将继续研究IL-10基因多态性与支气管哮喘临床诊断和治疗之间的关系，进一步丰富支气管哮喘的诊断和治疗的方案。

参 考 文 献

［1］中华医学会儿科学分会呼吸学组，《中华儿科杂志》编辑委员会. 儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016年版）［J］.中华儿科杂志，2016，54（3）：167-181.

［2］MOCELLIN M，de AZEREDO LEIT?O L A，de ARA′UJO P D，et al.Association between interleukin-10 polymorphisms and CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺T cells in asthmatic children［J］.J Pediatr （Rio J），2021，97（5）：546-551.

［3］DASTGHEIB S A，AARAFI H，BAHRAMI R，et al.Association of IL-10-1082G > A，-819C > T and-592C > A Polymorphisms with susceptibility to asthma in children：a systematic review and Meta-analysis［J］.Eur Ann Allergy Clin Immunol，2022，54（1）：4.

［4］NEDELKOPOULOU N，TAPARKOU A，RAFTOPOULOU S，et al.Association of IL-10 gene promoter polymorphisms with food allergy susceptibility and serum IL-10 level in a pediatric Caucasian population［J］.Pediatr Allergy Immunol，2021，32（3）：552-559.

［5］EL M H M， ISMAIL N A， HUSSEIN S，et al.Interleukin 10-1082 G/A gene polymorphism and susceptibility to bronchial asthma in children：a single-center study ［J］.J Interferon Cytokine Res，  2021，41（10）：385-390.

［6］KORPPI M，NUOLIVIRTA K，LAUHKONEN E，et al.IL-10 gene polymorphism is associated with preschool atopy and early-life recurrent wheezing after bronchiolitis in infancy［J］.Pediatr Pulmonol，2017，52（1）：14-20.

［7］邢飞，姜玉新，刘文艳，等. IL-10基因启动子多态性与皖南地区汉族人群支气管哮喘的相关性研究［J］.中国免疫学杂志，2012，28（7）：624-626，630.

［8］RAEISZADEH JAHROMI S，MAHESH P A，JAYARAJ B S，et al.IL-10 and IL-17F promoter single nucleotide polymorphism and asthma：a case-control study in south India［J］.Lung，2015，193（5）：739-747.

［9］KOPONEN P，NUOLIVIRTA K，VIRTA M，et al.Polymorphism of the rs1800896 IL10 promoter gene protects children from post-bronchiolitis asthma［J］.Pediatr Pulmonol，2014，49（8）：800-806.

［10］HOLSTER A，NUOLIVIRTA K，TRMNEN S，et al.Interleukin-10 gene polymorphism rs1800896 is associated with post-bronchiolitis asthma at 11-13 years of age［J］.Acta Paediatr，2019，108（11）：2064-2069.

［11］IMANI D，DASHTI N，PARVARI A，et al.Interleukin-10 gene promoter polymorphisms and susceptibility to asthma：systematic review and meta-analysis［J］.Biochem Genet，2021，59（5）：1089-1115.

（收稿日期：2022-07-22 修回日期：2022-12-05）

（编辑：梁明佩）