乌骨藤对胶原诱导性关节炎大鼠IL-33/ST2信号通路的影响*

祝波, 马武开, 陈菲菲, 杨玉涛, 安阳, 高雪琴, 刘振昆, 黄颖**

(1.贵州中医药大学 第二临床医学院, 贵州 贵阳 550002; 2.贵州中医药大学第二附属医院 风湿免疫科,贵州 贵阳 550001; 3.贵州中医药大学第二附属医院 体检治未病中心, 贵州 贵阳 550001)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以对称性多关节滑膜炎症为特征的慢性、全身性自身免疫性疾病[1],疾病后期可导致软骨和骨破坏,影响关节功能,造成关节畸形,严重影响个人生活质量,导致巨大的经济负担[2]。RA在我国的发病率0.42%,女性高于男性[3]。研究表明,RA与遗传因素、环境因素、炎症反应及自身免疫等因素有关,认为与辅助T细胞(Th1、Th2及Th17)及其相关细胞因子的异常激活有关[4]。Th1细胞主要参与细胞的炎症反应,并激活巨噬细胞,产生白细胞介素-2(interleukin 2,IL-2)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和γ干扰素(interferon-γ,INF-γ);Th2细胞激活B细胞,并产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10;Th17细胞受转录因子维甲酸受体相关孤儿受体γt(RORt)调节,主要产生IL-17、IL-22和INF-γ[5]。IL-33是一种前炎性细胞因子,可通过生长刺激表达基因2蛋白(growth stimulation expressed gene 2,ST2)轴募集一系列的炎性因子,促进机体炎症的发展[6]。当机体受到刺激时,IL-33与其受体ST2结合后通过相应免疫通路参与炎症、自身免疫心血管疾病的生和发展[7-8]。目前,西医治疗RA主要采用糖皮质激素、非甾体类抗炎药及改善病情抗风湿药等药物[9-10],中医药治疗RA有其特色、临床效果显著、不良反应少及安全性高[11]。乌骨藤具有抗炎、抗肿瘤及抗纤维化等药理作用[12],常用于治疗风湿痹痛,但作用及机制尚未见报道,本研究通过建立胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型大鼠,探讨乌骨藤对CIA大鼠IL-33/ST2信号通路相关因子的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 60只SPF级6周龄健康雌性Wistar大鼠,体质量(180±20)g,购自长沙天勤生物技术有限公司,动物合格证号SCXK(湘)2019-0013。所有大鼠在相同条件下喂养,自由饮食、饮水,室温18～22 ℃。

1.1.2实验药物及试剂 乌骨藤片(四川国康药业有限公司,批号20200914165023)、氟米特片(苏州长征一欣凯制药有限公司,批号201202)、牛Ⅱ型胶原(美国Chondrex公司,批号20021),完全弗氏佐剂(美国Sigma公司,批号F-5881)、醋酸(国药集团化学试剂有限公司,批号10000218),IL-4 ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,批号E-EL-R0014c)、IL-17 ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,批号E-EL-R0566c)、INF-γ ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,批号E-EL-R0009c)、L-33 ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司,批号CSB-E14077r);小鼠单抗β-actin 42 kD(武汉博士德生物工程有限公司,批号BM0627)、兔多抗sst 241 kD(批号Df7206)、兔多抗st2 l63 kD(批号Df2533)、兔多抗IL-33 31 kD(批号Df8319)均为美国Affinity公司产品。

1.1.3实验仪器 离心机(湘仪H1650-W)、电热恒温培养箱(日本ASONEICV-450)、FlexStation3多功能酶标仪(Molecular Devices,Flex Station3)、电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司CPA)、水平摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司TS-1)。

1.2 研究方法

1.2.1实验分组 60只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、来氟米特组及乌骨藤低、中、高剂量组,每组10只。

1.2.2动物造模及关节炎评分 除空白组外,其余各组参照文献[13]方法建立CIA大鼠动物模型。用0.1 mol/L冰释酸5 mL稀释10 mg牛Ⅱ型胶原溶解过夜,然后加入等体积的完全氟氏佐剂中,于大鼠尾根皮下多点注射0.3 mL,第7天后以同样方法再注射1次。第7天开始对大鼠踝关节、跖趾关节、趾关节红肿程度进行炎症评分,评分之和用关节炎指数(arthritis index,AI)表示,AI≥4分为关节炎症诱导成功,AI<4分判定为没有关节炎症发生[14]。

1.2.3给药 各组大鼠从造模第8天开始灌胃给相应药,按人与大鼠体重换算,以等效剂量为乌骨藤中剂量、其1/3剂量为低剂量、3倍剂量定为高剂量,乌骨藤低、中、高剂量组分别给予3 570、7 500、15 000 mg/(kg·d)灌胃;来氟米特组剂量为2 mg/(kg·d),空白组及模型组灌胃等体积生理盐水,每日灌胃1次,持续灌胃给药28 d。

1.2.4实验取材 取材于第28天末次灌胃后,予乌拉坦腹腔麻醉后行腹主动脉取血,3 000 r/min离心15 min,取上清液置-80 ℃冰箱保存;留取双后肢膝关节滑膜组织,取部分滑膜样本(0.1 g),置入PBS 1 mL 中,4 ℃捣碎匀浆,3 000 r/min离心10 min取上清,-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3 观察指标

1.3.1一般观察 动物精神、步态、被毛、活动情况、饮食及饮水量、粪便。

1.3.2AI 建模后第7天开始对大鼠踝关节、跖趾关节、趾关节红肿程度进行炎症评分,采用5级评分法:0分,无关节发红;1分,趾关节发红;2分,趾关节和足跖肿肿胀;3分,踝关节、趾关节和足跖关节肿胀;4分,踝关节在内的全部足爪肿胀;每个关节最高分为4分,4个关节累及积分记为每只大鼠的总分,分别计算各组大鼠灌胃前及灌胃第1、2、3、4周时AI。

1.3.3血清IL-4、IL-17、IL-33及INF-γ的水平 按试剂盒说明书操作,先加入标准品和待测样品,设置空白对照,37 ℃温育90 min,弃去孔内液体,加入生物素化抗体工作液,37 ℃温育60 min,加酶结合物工作液,37 ℃温育30 min,洗板5次,加显色剂,37 ℃避光孵育15 min,加入终止液,上酶标仪检测光密度D值,每组设5个复孔,重复3次,取平均值。

1.3.4大鼠膝关节滑膜组织中sST2、ST2L、IL-33蛋白表达水平 取出适量膝关节滑膜组织低温匀浆后加蛋白裂解液,在冰上裂解30 min,离心5 min、4 ℃,12 000 r/min,取上清。以BSA为标准,用Bradford法对上清液进行蛋白定量。取20 μg蛋白样品,10% SDS-PAGE电泳,设置恒压25 V转模。用封闭液(TBST)浸泡PVDF膜,室温封闭2 h,4 ℃孵育过夜。TBST洗膜5次,5 min/次,加入稀释好的二抗,室温摇床孵育2 h。再用TBST洗膜5次,5 min/次。ECL发光显影,用Band Scan分析胶片灰度值。

1.3.5检测大鼠膝关节滑膜组织中sST2、ST2L、IL-33基因表达水平 Trizol法提取RNA:取膝关节滑膜组织100 mg,加入Trizol试剂1 mL,用匀浆器萃取组织,移至无RNase的1.5 mL EP管中,裂解10 min。加入氯仿200 μL,剧烈颠倒混匀数次,室温放置5 min。4 ℃,12 000 r/min,8 min,转移上层水相至另一离心管,加入400 μL异丙醇,混匀,室温静置10 min。4 ℃,12 000 r/min,离心10 min。弃上清,加入75%乙醇,涡旋混匀,离心5 min(4 ℃,10 000 r/min)。弃上清,室温干燥5～10 min。加入20 μL DEPC水溶解RNA。取RNA2 μL,用显微分光光度计测量D260、D280、D260/D280值,计算RNA纯度和浓度。逆转录条件:50 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ 10 min,用相对定量Ct值法(2-ΔΔCt法)对数据进行定量分析。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence of real-time PCR

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况

空白组大鼠随着饲养时间的延长,精神状态良好,皮毛正常有光泽,活动自如,饮食饮水佳。模型组大鼠精神日渐萎靡,行走逐渐困难,毛发无光泽,饮水及饮水量减少。来氟米特组和乌骨藤不同剂量组大鼠的精神状态、营养状况和关节活动能力均优于模型组大鼠。

2.2 AI结果

与空白组比较,模型组大鼠AI明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),说明造模成功;给药第2周乌骨藤高剂量组的AI下降,与模型组及来氟米特组比较,差异有统计学意义(P<0.05);从给药第3周开始,各治疗组AI较模型组下降(P<0.05),乌骨藤组与来氟米特组疗效相当。见图1。

注:因空白组大鼠关节无肿胀,故在图中显示不出来;(1)与空白组比较,P<0.05;(2)与模型组比较,P<0.05;(3)与来氟米特组比较,P<0.05。图1 各组大鼠AI比较Fig.1 Comparison of AI among groups

2.3 血清IL-4、IL-17A、IL-33及INF-γ水平

与空白组比较,模型组大鼠血清中IL-17A、IL-33、INF-γ表达水平升高(P<0.05);与模型组比较,乌骨藤各剂量组及来氟米特组大鼠血清IL-17A、IL-33及INF-γ表达水平降低(P<0.05),且乌骨藤高、中、低剂量组大鼠血清中IL-17A、IL-33及INF-γ水平呈剂量依耐性减少(P<0.05);与来氟米特组比较,乌骨藤高剂量组IL-17A、IL-33、INF-γ表达水平较其降低(P<0.05),乌骨藤中剂量组与其相比疗效相当,差异无统计学意义,乌骨藤高剂量组IL-4表达水平较其明显升高(P<0.05)。见图2。

注:(1)与空白组比较,P<0.05;(2)与模型组比较,P<0.05;(3)与来氟米特组比较,P<0.05。图2 各组大鼠血清IL-4、IL-17、IL-33及INF-γ水平比较Fig.2 Comparison of serum IL-4, IL-17, IL-33, and INF-γ levels in various groups of rats

2.4 膝关节滑膜组织sST2、ST2L、L-33基因表达

与空白组比较,模型组大鼠膝关节滑膜组织sST2、ST2L、IL-33mRNA表达明显升高,具有统计学差异(P<0.05);与模型组比较,来氟米特组和乌骨藤高剂量组sST2、IL-33、ST2L表达降低,具有统计学意义(P<0.05);与来氟米特组比较,乌骨藤高剂量组sST2mRNA表达降低更明显(P<0.05)。见图3。

注:(1)与空白组比较,P<0.05;(2)与模型组比较,P<0.05;(3)与来氟米特组比较,P<0.05。图3 各组大鼠sST2、ST2L、IL-33mRNA表达Fig.3 Expression level of sST2,ST2L, and IL-33 mRNA in each group

2.5 膝关节滑膜组织sST2、ST2L、IL-33蛋白表达

与空白组比较,模型组大鼠膝关节滑膜组织sST2、ST2L、IL-33蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,来氟米特组和乌骨藤高剂量组sST2、ST2L、IL-33蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),且两组sST2、ST2L和IL-33蛋白表达水平相当。见图4。

注:A为空白组,B为模型组,C为来氟米特组,D为乌骨藤低剂量组,E为乌骨藤中剂量组,F为乌骨藤高剂量组;(1)与空白组比较,P<0.05;(2)与模型组比较,P<0.05。图4 各组大鼠sST2、ST2L、IL-33蛋白表达水平比较Fig.4 Expression level of sST2,ST2L, and IL-33 proteins in each group

3 讨论

RA属于中医学“痹症”范畴。中医学认为痹症是以虚为本,以实为标之症,其病因病机可概括为素体虚弱,气血不足,加感风、寒、湿等外邪痹阻经络所致。中医治疗主要以扶正祛邪通经、活血止痛为主[15]。藤类药物是我国临床中药学重要组成部分,被广泛应用于治疗中医痹症。现代药理研究发现,藤类药物主要具有镇痛、消肿和促进外周血循环等作用,主要是由其化学成分木脂素、生物碱和挥发油通过发挥抗炎、抑制血小板聚集和调节反射机制的作用[16]。乌骨藤又叫通关藤,出自《贵州民间药物》,具有祛风除湿、通经活血、散结消炎止痛之效,是我国西南地区常用的民族药之一[17]。目前治疗RA的中药复方中也常见此味中药,但对其抗炎、抗风湿作用机制鲜有报道。来氟米特是免疫抑制剂中的其中一种,对T细胞的增殖与活化具有抑制作用,可抑制相关炎性细胞因子的分泌,增强免疫抑制[18],因此本研究选用来氟米特作为阳性对照组。

研究表明,IL-33/ST2信号通路是免疫功能障碍和炎症反应的关键通路[19]。ST2可调节IL-33的活性,当机体受炎症、肿瘤、创伤及应激等不良因素入侵时,IL-33作为前炎症性细胞因子分泌到细胞外,与其受体ST2结合激活下游信号,从而影响多种细胞因子及趋化因子的产生与分泌,导致Th1/Th2免疫应答平衡失调,促使炎性反应发生发展[20-21]。T淋巴细胞上ST2的表达被证明可驱动Th2型细胞因子的产生,负责感染和组织修复期间的炎症反应。ST2耗竭可导致Th1/Th17反应增强和抗肿瘤免疫[22]。IL-33与ST2L及IL-1R辅助蛋白(interleukin-1 receptor accessory protein,IL-1RAcP)结合产生异二聚体受体复合物,募集髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、IL-1R相关激酶1/4(interleukin-1 receptor-associated kinase1/4,IL-1RAK1/4)、TNF受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAP6),通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和活化B细胞的核子-κ轻链增强(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)途径使下游转录因子激活[23]。ST2特异性抗体或sST2可以拮抗IL-33与ST2L受体的结合抑制下游反应。正常情况下,血清sST2含量较低。IL-33/ST2L通路的激活促进Th2的免疫炎症反应,促进sST2表达增加,负向调节Th2反应[20]。当IL-33与特定受体ST2结合后,刺激细胞因子分泌,包括抗炎因子IL-4、IL-5、IL-13,炎症刺激因子IFN-γ和TNF-α等增强炎症反应,促进疾病进程的发展[24]。

本次实验结果显示,乌骨藤能够下调CIA大鼠sST2、ST2L、IL-33基因及蛋白表达水平,呈剂量依耐性降低血清炎症因子IL-17A、IL-33、INF-γ表达水平,上调抑炎因子IL-4水平,提示乌骨藤可能通过抑制调控IL-33/ST2信号,减少炎症因子对滑膜细胞的浸润,增加抑炎因子,降低AI,进而缓解RA的炎症反应。乌骨藤高剂量组与RA一线用药来氟米特对CIA模型鼠治疗效果相当。本研究为RA的研究和治疗提供了一定的实验依据,表明乌骨藤可能是有效治疗RA的藤类药物,值得进一步研究。