RA患者microRNA-155调节免疫细胞分化的机制研究

杨瑞宾 国学红 周成英 吴雪梅

(兴义市人民医院,贵州 兴义 562400 )

类风湿性关节炎(RA)是一种比较常见的慢性炎症性自身免疫性疾病,对称性的手、足小关节的慢性滑膜炎及血管炎为本病的基本特征。miRNA是一类抑制编码基因表达的调控基因,其主要通过结合特定的靶mRNA的3’非编码区使其降解或抑制其翻译过程以影响目的基因的表达[1]。研究[2]表明,miR-155是与人体免疫密切相关的非编码RNA,在单核巨噬细胞、中性粒细胞及TB细胞等各种免疫细胞表面发挥免疫调节效应。miR-155可通过调节T细胞在自身免疫性关节炎、银屑病、动脉粥样硬化等多种自身免疫性疾病及免疫炎症中发挥作用。本研究旨在探讨RA患者miR-155如何调节CD4+T细胞亚群Th17及Treg细胞的分化及其特异性转录因子和细胞因子的表达,从miRNA的角度研究RA免疫功能紊乱的调节作用及其分子机制,为RA的防治、病情监测提供新思路和理论依据。

1 对象与方法

1.1研究对象 收集2018年8月至2020年10月本院风湿免疫科RA患者62例为研究对象,其中轻度RA患者37例,重度RA患者25例。所有RA患者均符合美国风湿病协会1987年修订的诊断标准并排除肿瘤及其它自身免疫性疾病。活动期RA患者需符合RA诊断标准+关节肿胀≥3个且同时满足以下条件中任意2条:关节内或者周围晨僵≥1个小时;关节肿痛≥5;ESR≥28 mm/h;CRP↑≥1.5倍正常值。对照组选择同期在我院体检的健康者30例,男21例,女9例,年龄2～74岁;轻度RA患者男10例,女27例,年龄5～76岁;重度RA患者男2例,女23例,年龄25～77岁。根据知情同意原则,所有研究对象均签署知情同意书并获得本院伦理委员会同意。RA组与健康对照组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法 采集所以研究对象空腹静脉血5 mL至EDTA抗凝的紫色无菌管内,离心收集血浆。密度梯度法离心获取外周血单个核细胞(PBMCs)用Trizol LS和Trizol试剂分别提取外周血血浆及PBMCs中的RNA,逆转录合成CDNA,以其为模板,RCR扩增各目的基因。RT-qPCR法检测RA患者及健康对照组外周血中miR-155、SOCS1、JAK3、RORγt 、SATA3、SATA5、Foxp3 的mRNA的表达情况,用免疫荧光法检测IL-2、IL-6、IL-10、IL-17等细胞因子的表达情况;用免疫印迹分析(Western boltting)检测SOCS1、JAK3、RORγt、SATA3、SATA5、Foxp3靶基因及相关信号通路中重要蛋白的表达情况。采用电化学发光法、免疫散射比浊法及胶乳增强免疫比浊法分别检测各组研究对象血清中A-CCP、CRP、ASO与 RF含量;所有操作严格按照说明书进行。

1.3统计学方法 采用SPSS 22.0、Graph prism 5.0统计软件对数据进行统计并分析,正态分布的计量资料多组间均数比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验;非正态分布的计量资料采用秩和检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1miR-155、SOCS1、JAK3等基因的mRNA及其蛋白表达情况 RA患者外周血中miR-155mRNA、JAKmRNA3及其蛋白表达水平显著高于健康对照组(P<0.05),且重度组RA患者miR-155mRNA、JAKmRNA3及其蛋白较轻度组RA患者更高(P<0.05);SOCS1mRNA及其蛋白表达水平在RA患者外周血中明显低于健康人群(P<0.05),且重度组RA患者SOCS1mRNA与其蛋白表达水平较轻度组RA患者更低(P<0.05)。见图1。

2.2调控Th17细胞分化相关STAT3/RORγ通路分子的mRNA及其蛋白表达情况 RA患者外周血中STAT3mRNA、RORγtmRNA及其蛋白表达水平较健康对照组明显升高(P<0.05);且重度组RA患者STAT3mRNA表达水平及蛋白P-STAT3/STAT3、RORγt/β-actin表达水平较轻度组升高更明显(P<0.05)。见图2。

2.3调控Treg细胞分化相关STAT5/Foxp3通路分子的mRNA及其蛋白表达情况 RA患者外周血中STAT5mRNA及其蛋白、p-STAT5蛋白相对表达水平明显低于健康对照组(P<0.05),且重度组RA患者STAT5mRNA及其蛋白、p-STAT5蛋白表达水平较轻度组患者表达更低(P<0.05);Foxp3mRNA及其蛋白在重度RA患者外周血中表达明显低于健康对照组(P<0.05),在轻度RA患者中Foxp3mRNA降低不明显(P>0.05)。见图3。

注:Treg细胞分化相关STAT5/Foxp3通路分子在类风湿性关节炎患者外周血中的表达变化图3 与对照组相比较,*P<0.05;与轻度组相比较,#P<0.05。

2.4外周血中miR155、SOCS1、SATA3、SATA5、ROPγt、FOXP3、JAK3mRAN含量 RA患者外周血中miR-155 mRNA、JAK3 mRNA、SATA3 mRNA、RORγt mRNA及其蛋白表达水平明显高于健康对照组(P<0.05),且与疾病严重程度相关;而SOCS1 mRNA、SATA5 mRNA、Foxp3 mRNA及其蛋白表达水平明显低于健康对照组,且与疾病严重程度相关(P<0.05)。见表1。

表1 RA组与对照组外周血中miR155、SOCS1、SATA3、SATA5、ROPγt、FOXP3、JAK3mRAN含量比较

2.5外周血中IL-2、IL-6、IL-10、IL-17等细胞因子的表达情况 RA患者外周血中细胞因子IL-2、IL-10、IL-17表达水平显著高于健康对照组(P<0.05),且重度组RA患者较轻度组RA患者升高不明显(P>0.05);细胞因子IL-6表达水平显著高于健康对照组(P<0.05),且重度组患者IL-6表达水平明显高于轻度组(P<0.05)。见表2。

表2 免疫荧光法比较RA各组与对照组血清中IL-2、IL-6、IL-10、IL-17含量

2.6血清中A-CCP、ASO、RF、CRP等炎性因子的表达情况 RA患者血清中炎性因子A-CCP、RF含量均显著高于健康对照组(P<0.05),且重度组A-CCP含量较轻度组升高更显著(P<0.05);重度组CRP含量显著高于健康对照组及轻度组(P<0.05)。见表3。

表3 RA各组与对照组血清中A-CCP、ASO、RF、CRP含量比较

3 讨 论

miRNA是具有免疫调控功能的非编码小分子RNA,miR-155为其家族成员且生物学活性广泛,其可通过多种途径调控T细胞的分化与功能,在维护免疫系统稳态过程中起到了重要作用。本研究通过检测miR-155、JAK-STAT信号通路分子、SOCS1等基因的mRNA及蛋白在RA外周血的表达情况,以探讨其在RA中的致病机制。

本研究结果显示,RA患者外周血miR-155mRNA表达显著高于健康对照组(P<0.05),且重度RA患者其miR-55 mRNA表达较轻度RA患者更高(P<0.05),说明miR-155参与RA调节免疫应答反应,且与病情严重程度相关;结果还显示RA患者外周血中SOCS1mRNA及其蛋白水平显著低于健康对照组(P<0.05),JAK3mRNA及其蛋白表达水平显著高于健康对照组(P<0.05),RA患者外周血STAT3mRNA、P-STAT3mRNA、RORγtmRNA及其蛋白表达水平也显著高于健康对照组(P<0.05),此结果提示活化的STAT3蛋白参与RA的发生发展过程。STAT3蛋白的活化对转录因子RORγt的表达与调控起关键作用,上调STAT3可促进其RORγt表达致使活化的CD4+T细胞向Thl7细胞分化。本研究结果还显示,RA患者外周血STAT5mRNA、P-STAT5mRNA、Foxp3mRNA及其蛋白表达水平均显著低于健康对照组(P<0.05),且与疾病严重程度呈负相关(P<0.05)。研究[3]表明,STAT5是JAK/STAT信号传导通路中对Treg细胞分化起关键的作用的信号转导与转录激活因子,STAT5蛋白的活化对转录因子Foxp3的表达与调控起关键作用。上调STAT5可促进核转录因子Foxp3表达致使活化的CD4+T细胞向Treg细胞的分化,反之则抑制Treg细胞的分化。Th17细胞是引起自身免疫性疾病和宿主炎症反应中造成组织损伤的关键因子,且参与了RA免疫炎症反应、滑膜增殖、骨侵蚀多个病理环节。其分泌的主要致炎因子IL-17以激活补体、活化中性粒细胞释放炎症性因子方式介导组织的炎症反应。IL-17、IL-1、IL-6、TNF-α等致炎因子联合作用可加快血管翳形成与关节软骨破坏,致使关节炎症进一步加重[4-7]。本研究提示RA患者外周血中Th17细胞数量较健康对照组明显升高,且重度RA患者外周血中Th17细胞数量较轻度RA患者升高更明显,RA患者外周血中IL-17、IL-6表达水平也显著高于健康对照组,且与疾病严重程度成正相关。Treg细胞是一类具有免疫调节作用的CD4+T细胞亚群,其可以通过降低炎性细胞因子产生、减少抗体分泌,进而维持自身免疫耐受。Treg细胞抑制自身免疫性炎症反应主要通过分泌细胞因子TGF-β和IL-10以抵抗其它CD4+T亚型细胞的分化与炎性介质的释放。被一系列研究[8-9]表明,RA发病机制中的关键环节在于Th17/Treg之间的免疫失衡状态及相关的细胞因子微环境发生了改变。赵俊桃等[10]实验发现RA患者外周血Th17细胞数量明显减少,Treg细胞数量明显降低,且二者都与病情严重程度相关。本研究结果显示,RA患者外周血Treg细胞数量明显低于健康对照组,且重度RA患者外周血Treg细胞数量更少,提示RA患者存在免疫耐受下降;结果还显示,A-CCP、RF等炎性因子在RA患者外周血中高表达,参与RA的致炎过程,并且其特异性与敏感性较高,可用于评估类风湿关节炎的严重程度。然而,免疫荧光法检测结果却发现RA患者血清中IL-10 细胞因子水平较健康对照组却明显升高,Treg细胞数量与IL-10表达水平发生不一致的现象,有可能与标本类型的差异或病程与活动度有关,也可能RA患者体内多种信号转导通路被激活有关,有待进一步研究。

综上所述,在RA的炎症过程中,miR-155参与调控着RA众多的基因及信号蛋白的表达。在CD4+T细胞分化过程中,miR-155可能通过抑制细胞因子信号传导抑制物SOCSl的表达而上调JAK/STAT信号通路中核转录因子STAT3及其细胞特异性转录因子RORrt的表达,进而促进Th17细胞的分化及细胞因子IL-17、IL-6的表达;通过下调JAK/STAT信号通路中核转录因子SATA5及其细胞特异性转录因子Foxp3途径以抑制Treg细胞的分化。RA患者中存在Th17/Treg细胞之间免疫失衡状态及多种炎性因子水平异常表达,二者均参与了RA发病过程。(图1、图2见封三)。