季铵盐类化合物抗菌剂制备与性能测试及抗菌材料的应用影响*

2023-07-12袁力李治

粘接 2023年6期

袁力　李治

摘要：鉴于材料表面容易出现各类有害菌，导致材料被腐蚀，而且这些有害菌大量繁殖还会进一步威胁环境安全与人们的身心健康。研究借助于诸多反应完成基于季铵化聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯接枝的琼脂糖（Agr-g-QPDMAEMA）抗菌剂制备，并对其抗菌性加以分析。借助于四苯乙烯（TPE）与抗菌多肽衍生物共同进行“硫醇-烯烃”加成反应，从而完成TPE-AMP抗菌剂制备。这种抗菌剂能够实现聚集诱导发光效应，在接触细菌之后，荧光信号就会产生改变，这样就能从微观层面展现该抗菌剂与细菌膜的作用，从而对其抗菌效果进行分析。

关键词：季铵盐；化合物；抗菌剂；制备；抗菌性能

中图分类号：TQ460.31 文献标志码：A文章编号：1001-5922（2023）06-0123-04

Preparation and test of antimicrobial properties of quaternary ammonium and the application effect of antibacterial

YUAN Li，LI Zhi

（1.Hanzhong Vocational and Technical College，Hanzhong 723000，Shaanxi China;2.Medical College University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，Shaanxi China）

Abstract：There are many kinds of harmful bacteria on the surface of materials，which not only cause the materials to be corroded or defaced，but also threaten the environment security and people's physical and mental health.In this study，quaternary ammonium salts were used as models to prepare agarose （AGR-g-QPDMAEMA），which was grafted with Quaternary polydimethylaminoethyl methacrylate （DMMA） by many reactions，and the antimicrobial activity was analyzed.Then the antibacterial agent TPE-AMP was prepared by“Mercaptan-olefin” addition reaction of tetrastyrene （TPE） and antibacterial polypeptide derivatives.The antibacterial agent can achieve the aggregation-induced luminescence （AIE） effect，and after contact with bacteria，the fluorescence signal will be changed，so that from the micro-level the effect of the antibacterial agent and the bacterial can be shown，and the antibacterial effect can be analyzed.

Key words：quaternary ammonium salt;compound;antibacterial agent;preparation;antibacterial property

有害菌长期共存于我们生活的诸多角落，不仅容易导致食物变质，也会使得棉纤维、医疗设备等遭受污染，这必然给人们的生活带来很多危害。为此，对这类危害进行解决就显得颇为关键。抗菌剂的问世在解决这类危害方面无疑是重要的举措。

如今，很多國家都积极推动抗菌剂开发，并且投入很多人财物力。我国虽然在此领域的研究开展的较晚，但是进度快，有着颇高的开发潜力。

1 抗菌剂分类与作用机理

如今在市场中出现了多种不同的抗菌剂，它们的作用、性能和结构存在着显著不同，按照差异性分类方法，抗菌剂能够细分为基于抗菌剂的释放速度与量的差异，可以将其细分成溶出性与非溶出性抗菌剂。一般而言，主要基于抗菌剂化学成分的差异，将其分成无机、有机、复合抗菌剂［1］。

1.1 抗菌剂分类

1.1.1 无机抗菌剂

无机抗菌剂主要是通过银、铜、锌等金属离子的抗菌能力，利用物理吸附或离子交换等方式在某些载体上进行改良，进而达到预防疾病的活性。其中，载体包括活性炭、磷酸盐、粘土、SiO2以及沸石。抗菌机理存在较大的差异，无机消毒剂通常含有光催化消毒剂以及金属离子消毒剂。

1.1.2 有机抗菌剂

有机抗菌剂在我们的日常生活中随处可见，比如实验室或药房的甲醛杀菌，自来水厂经常使用的氯气消毒杀菌等。有机抗菌剂开发成熟，起步早，种类多杀菌效果较为优秀，在抗菌剂市场处于领先地位。合成抗菌剂以及天然抗菌剂2大类为目前的有机抗菌剂。

1.1.3 复合抗菌剂

无机与有机抗菌剂基于自身特点能够应用于不同领域，不过它们的优势发挥依然有着较多局限性，这使之抗菌活性受到一定的负面影响。为此，不少学者试图将这2种抗菌剂进行综合，实现优势互补，从而切实有效的提升抗菌效果。日本在1993年就出现了酚醛复合抗菌剂，其中带有金属离子［1］。这种复合抗菌剂就是将有机与无机抗菌剂借助于理化反应获得全新的抗菌剂，使之性能得到极大改善，而且在应用范围上实现了显著扩大，耐热性与持久性显著改善。这种复合抗菌剂的制作模式主要为：

（1）以无机载体为基础，掺入有机抗菌剂，从而完成复合；

（2）将有机抗菌剂作为基础，掺入无机抗菌剂，从而完成复合；

（3）将其他抗菌剂与稀土离子共同产生配合物，从而完成复合。

此时需要对2种抗菌剂实现机制、反应度、复合难易度等进行综合分析，要进行针对性复合［2-3］。虽然复合抗菌剂对应的机理目前没有全面清楚，不过它兼有其他2种抗菌剂的优势，而且还能为环境友好型提供良好支持。为此，这种复合抗菌剂需要积极推动发展，使之朝着产业化方向转变。

1.2 抗菌剂的作用机理

抗生素的抗菌作用是扰乱和破坏与微生物疾病有关的组织、代谢活动以及生化反应，进而杀死或抑制细菌的生长发育。各个抗菌剂其抗菌机理也具有较大差异，同一种抗生素也可能存在于不同产品的不同抗生素中。应用于抗菌材料的抗菌剂的作用机理主要包括以下几种。

（1）催化活化机理。有几种金属可以充当催化剂，例如银、钛和锌。活性位点可以从环境中吸收能量，如紫外线、空气或水中的氧气，产生活性羟基自由基和氧离子。它能氧化或与细胞内的蛋白质、不饱和脂肪酸和糖苷类发生反应，破坏它们的正常结构，从而使它们死亡或失去繁殖能力；

（2）金属离子接触反应。由于金属离子带正电荷，当大量金属离子与细菌细胞膜接触时，与细胞膜发生负向库仑引力，促使二者之间发生反应，金属离子进入细胞膜并进入生物，氨基与其他基团发生反应。细胞蛋白质活性位点的结构被破坏，导致细菌死亡或失去分裂和生长的能力；

（3）阳离子固定机理。抗生素产品的阳离子（如季铵盐基团）会吸引负菌，束缚细菌的活性，抑制其呼吸作用，根据电场的吸引顺序，发生死亡现象。细胞壁和细胞膜上的细胞内负电荷失衡导致变形，细胞中的水和蛋白质可以从体内逸出，导致腐烂和死亡。

2 季铵化聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯接枝的琼脂糖抗菌剂的制备

2.1 Agr-Br大分子引发剂的制备

选用圆底烧瓶（容量为250 mL），然后在其中分別掺入N，N-二甲基乙酰胺（DMAC）和琼脂糖（Agr），前者为150 mL，后者为6 g，然后将其置入120 ℃环境，用时4 h，直到溶液为透明无色状态，并直至室温。量取DMAC与三乙胺（TEA），分别为10、3.87 mL，将其混合，并在冰水浴下，将其慢速滴入此溶液，随后将DMAC（10 mL）和2-溴异丁酰溴（BIBB，3.43 mL）混合液滴入此溶液。在室温环境中等待24 h，将反应液转移至过量乙醇，将沉淀进行洗涤、抽滤等，并在50 ℃真空环境中进行12 h干燥，就能获得Agr-Br大分子引发剂，它呈现出白色絮状固体［4］。

2.2 Agr-g-PDMAEMA的制备

选用圆底烧瓶（容量为100 mL），向其中分别增添DMF（N，N-二甲基甲酰胺）与上述大分子引发剂，前者使用30 mL，后者为2 g，然后在60 mL环境下进行搅拌，直至透明无色，然后静置至室温。接着量取CuBr，将其置入此溶液，其量为0.3 g，搅拌数分钟，随后再量取DMF和DMAEMA（甲基丙烯酸二甲氨乙酯）混合液，分别为12、8.89 mL，将其慢速转移至此反应液，直至变成绿色［5］。随后向此溶液通入20 min的氩气，并将联吡啶0.65 g置入此反应液，在油浴且60 ℃环境中，溶液逐步转变成褐色粘稠态。接着通过蒸馏水与EDTA水溶液加以透析，然后再进行冷冻干燥，就能得到Agr-g-PDMAEMA1，呈现出棕褐色固态［6］。当然，另外一组则借助于不同单体比例实验，分别掺入DMF和DMAEMA混合液，分别为15、13.33 mL，按照上述方法完成Agr-g-PDMAEMA2的制备。

2.3 Agr-g-QPDMAEMA抗菌剂的制备

选择圆底烧瓶，容量为100 mL，然后向其中加入DMF和Agr-g-PDMAEMA，分别为40 mL和3 g，然后在油浴环境中，基于60 ℃，对其进行搅拌，直至透明黄色状，接着静置至室温。接着慢速滴入DMF与溴代正丁烷混合液，它们分别为2.57、2.05 mL。在60 ℃下进行5 h反应，随后将反应液置入过量乙醇，获得沉淀通过离心、洗涤等处理，并进行干燥（50 ℃），就能获得Agr-g-QPDMAEMA（白色固体），图1所示为反应步骤。

3 抗菌性能测试

3.1 Agr-g-QPDMAEMA抗菌性能测试

为了分析革兰氏阳性、阴性菌受到Agr-g-QPDMAEMA的抗菌效应，本次实验利用微量肉汤稀释法，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌展开最低抑菌浓度实验（MIC）。此次实验，因为Agr-g-PDMAEMA不能溶于水，为此，最终选择Agr-g-QPDMAEMA展开此次实验［7］。对于大肠杆菌进行MIC实验，Agr-g-QPDMAEMA1/2得到的值皆为64 μg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC值，则依次为128、64 μg/mL。对MIC值进行对比能够得出，该聚合物对这两种有害菌的生长都有抑制作用，而且在抗菌效果上也能媲美其他季铵盐类抗菌剂。此外，该聚合物对大肠杆菌的MIC值更小，这意味着它在抑制此菌方面的效果更优［8］。

3.2 Agr-g-QPDMAEMA血液相容性测试

为了对抗菌剂的血液相容性进行分析，可以选择新鲜兔血，将Agr-g-QPDMAEMA掺入其中，然后对溶血率进行观察。通常，溶血活性能够通过HC50定义，具体就是对兔血红细胞破坏50.0%时对应的聚合物浓度。本次实验的抗菌剂在PBS缓冲液中有着一般性的溶解度，最大值为2.5 mg/mL。不同质量浓度的此抗菌剂与兔血进行1 h作用，后者溶血率都小于20.0%。这意味着质量浓度达到极大值时，该溶血率也相对较低，这意味着此抗菌剂的毒性较低，具有较佳的血溶性。抗菌剂对细菌的选择性可以借助于HC50／MIC比值来进行表示，此值越高，意味着细菌选择性越高［9-11］。通过计算，Agr-g-QPDMAEMA1/2在选择大肠杆菌时，比值超过39，而金黄色葡萄球菌对应的比值则分别为19、39。该值与其他阳离子型聚合物值有着较高的一致性。

3.3 Agr-g-QPDMAEMA凝胶抑制空气中细菌附着测试

琼脂糖具有物理交联，可以产生热敏性凝胶。在此属性下，会让Agr-g-QPDMAEMA固化，进而产生抗菌凝胶。这是伤口填充剂、敷料所垂青的生物材料，得到了极大瞩目。本次实验将Agr-g-QPDMAEMA2依次溶解至营养肉汤与胰蛋白大豆肉汤，分别使用NB和TSB表示，然后趁热将其置入培养皿，待凝固之后，就能制备相应凝胶。接着通过喷壶将细菌溶液喷洒至凝胶表面，进而分析该凝胶对空气中细菌附着力的抑制效应，该细菌溶液通过PBS配制，为1×105 cells/mL。该抗菌剂凝胶与未改性琼脂糖凝胶统一置于37 ℃培养箱之中，等待18 h，后者表面的2种有害菌出现了菌落［12］；而前者基本上看到这2种有害菌。由此可见，前者凝胶对空气中的细菌有着较高的抑制效果。

3.4 Agr-g-QPDMAEMA凝胶敷料预防细菌感染测试

钛及其合金存在着颇高的生物相容性，同时还具有颇高的耐腐蚀与机械性能等。为此，在生物医药移植领域得到颇广运用。然而钛系合金也有自身局限性，容易被细菌感染进而难以移植。为此遭受感染的钛片就能衡量出凝胶敷料的抑菌效应。本次研究将钛片首先置于细菌悬浮液之中（1×107 cells/mL），耗时4 h，该悬浮液PBS配置。接着利用PBS完成3次清洗，将附着差的细菌进行去除，随后将被细菌感染的钛片分别置于Agr-g-QPDMAEMA2凝胶敷料与未改性琼脂糖之上［13］。然后利用涂板计数法对存活的细菌数量进行定量检测。在4 h作用后，表面存活的2大有害菌在数量上基本相近，大肠杆菌与金黄色葡萄球菌分别为5.5×105、4.8×105 cells/cm2。该钛片载荷后者琼脂糖作用24 h，环境为37 ℃时，钛片2种有害菌显著增长，对应密度进一步增长至1.2×107 cells/cm2和4.4×106 cells/cm2。然而和前者凝胶敷料作用相同时间与温度，这2种有害菌密度分别减少至5.4×103、2.3×104 cells/cm2，相较于开始的钛片，其细菌数量分别下降9.9、9.5。这意味着该凝胶敷料有着颇高的抑菌效果，同时还能对表面附着的细菌进行杀死。

4 抗菌材料的应用影响

4.1 水处理影响

水溶性消毒剂与氯在处理水时，将会存在着一定的残留，这必然对人们的健康、环境带来负面作用。另外，游离氯离子以及相关化合物还会与水中的有机物进行反映，进而生成三卤甲烷，这具有颇强的致癌性。为此，这类水处理剂需要被严禁使用。对这些问题进行解决的方法就是制备抗菌材料，且具有不溶性，将接触的微生物杀死，抗菌物质不会被迁移。应用于水处理的抗菌材料具有多元性，主要为抗菌纤维与涂层。其优势就是加工简单，而且与水不相溶。在PP无纺布上通过接枝工艺将4-乙烯基吡咯烷酮（4-VP）转接至前者表面，接着通过卤代烷将其季铵化，由此就能制作相关改性PP无纺布。结果显示，这種无纺布可以对水体细菌进行高效捕捉，其中通过溴化苄季铵化的PP无纺布，有着最广的捕捉范围。大肠杆菌从形貌角度来看，与活菌并无明显不同，这意味着该无纺布虽然不能杀菌，但是可以很好抑制细菌繁殖。

4.2 生物医疗影响

很多药理学试剂为典型的小分子，它能够很好的渗透至细胞，然而，很快就能从人体外排，为了达成治疗效果，就需要使用相应的小分子试剂。然而，这些试剂的药理学特性相对有限，同时还会产生毒副作用。为此，将这类抗菌试剂负载至聚合物主体之上，就能减慢在人体中的代谢速率，进而对其治疗的有效时间进行延长。最为高效的方法就是将对应化学键对接至生物相容性较佳的聚合物分子链之上。在聚乳酸等聚合物上负载盐酸四环素，就能成功制作静电纺丝纤维，而这种材料就能用作创口贴。

4.3 食品包装和传送影响

细菌繁殖、感染对食品的保险期限有所降低，使得食物导致的疾病概率有所提升。少量加工与处理之后，更容易储藏，全球化贸易以及人们对食品新鲜度的需求，给食品的质量与安全带来更多挑战，使得抗菌食品包装受到极大的关注。陈旧的保护食品免受细菌侵害的方法包括热处理、冷藏、脱水和添加一些抗生素，但此类办法不适用于鲜肉和即食食品。抗菌产品所携带的抗生素基团可以与食品接触，从而抑制细菌的生长，减少加工食品回收利用的可能性，促进更好地生产自抗菌食品，从而方便食品的储存时间。由于聚氨酯易于清洁且具有良好的性能，因此在食品输送机上使用它可以减少饮用水并节省环境清洁成本。 N-卤胺聚氨酯抗菌产品对大肠杆菌和表皮葡萄球菌具有良好的抗菌性能，灌装20次后仍保持抗菌性能，细菌存活时间非常长，一般为4周。此改性方法对力学性能并没有产生影响，以后可以直接用于接触食品的领域，比如食品传送带。

5 结语

抗菌多肽（AMPs）和季铵盐类化合物都具有低毒、不容易出现耐药性等优势。在研究中，将季铵盐类化合物作为核心模型，借助于诸多化学反应，制备获得Agr-g-QPDMAEMA，进而对它的抗菌性能展开分析。若是将Agr-Br和DMAEMA按照1∶26.1比例进行配比，那么该抗菌剂的季铵化水平会达到75.8%，在抗菌方面的效果达到最优。它对2种有害菌的MIC值，皆为64 mg/mL，而且对血红细胞也有颇高的血溶性。其中HC50超过2.5 mg/mL。对于TPE-AMP来说，属于典型的低毒抗菌剂，在溶液之中有着较弱的荧光，在于细菌进行作用之际，荧光信号就会显著强化。而且它与革兰氏阳性菌有着更高的作用信号，这和低MIC值存在着较高的呼应关系。为此，基于微光角度的荧光技术就能对TPE-AMP抗菌效果进行判定。根据该荧光信号的改变，就能为了解细菌膜与TPE-AMP的有关作用提供了便捷、快速之法，而且还能为抗菌效果分析提供良好支持。

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