雷公藤甲素对胶质瘤的影响
2023-07-10陈晓宇石文文支园园张淑君
陈晓宇 张 爽 石文文 支园园 张淑君
1.哈尔滨医科大学附属第四医院病理科，黑龙江哈尔滨 150001；2. 山东省烟台毓璜顶医院病理科，山东烟台 264099；3.哈尔滨医科大学附属第六医院，黑龙江哈尔滨 150028
脑胶质瘤是常见的颅内原发性肿瘤之一，大多数属于恶性肿瘤，肿瘤细胞分裂快、浸润性强，易损伤病灶周围组织，治疗难度大，预后差。而且部分脑胶质瘤患者术后仍会发生肿瘤复发，因此，急需研制出新型的抗肿瘤药物用于临床治疗[1-2]。近年来，多项研究表明雷公藤甲素在乳腺癌、肺癌、宫颈癌等多种肿瘤的治疗中也表现出较好的疗效[3-9]。本研究即在体内体外两种水平上研究胶质瘤中雷公藤甲素对其增殖迁移能力的影响，并探讨该作用是否与mir-221 相关。该研究可能为胶质瘤诊断与治疗提供有效的标记物、为胶质瘤细胞增殖及侵袭的作用机制提供有力的理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料
第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的 基 因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）抗体购于 abclonal 公司，mir-221 购于吉玛基因公司，雷公藤甲素购于阿拉丁公司，wistar 大鼠由哈尔滨医科大学附属第二医院提供，大鼠胶质母细胞瘤C6 细胞系购于普诺赛公司，-80℃超低温冰箱来自Haier 公司，-20℃医用低温冰箱来自美菱公司，4℃医用冷藏冰箱来自美菱公司，光学显微镜来自Olympus 公司，电泳槽来自Bio-Rad 公司，转膜仪来自Bio-Rad 公司，PCR 试 剂 盒是SYBR Green Pro Taq HS，TAKARA公司，纳米制剂由哈尔滨医科大学附属第四医院分子影像重点实验室提供。本研究已通过哈尔滨医科大学附属第四医院中心实验室动物实验伦理审查。
1.2 方法
1.2.1 动物实验
1.2.1.1 实验分组及动物处理 实验动物为wistar大鼠。本研究首先完成了大鼠的造模，并通过MRI筛选出了胶质瘤造模成功的大鼠。本实验分为四组：①纳米用药组（雷公藤甲素纳米给药组注射含62.5 g的雷公藤甲素纳米制剂）；②普通用药组（注射含62.5 g 的雷公藤甲素的生理盐水）；③生理盐水组（注射生理盐水）；④胶质瘤癌旁组织组。每日记录鼠的生存状态。持续7 d 后再次进行MRI 观察。
1.2.1.2 蛋白质免疫印迹（Western blot）检测 收集大鼠脑组织蛋白样品，经电泳、转膜、封闭、孵育抗体等步骤进行蛋白检测。
1.2.1.3 聚 合 酶 链 反 应（polymerase chain reaction，PCR） 抽提样本的RNA，经过纯化、质量检测等步骤进行实时定量PCR。PCR 引物：上游，ACACTCCAGCTGGGAGCTACATTGTCTGCTGG；下游，CTCAACTGGTGTCGTGGA。
1.2.2 细胞实验
1.2.2.1 实验分组及细胞处理 实验细胞为贴壁生长的C6 细胞。本实验分为四组：①对照组（NC组）；②低浓度用药组（20 ng/ml）；③中浓度用药组（55 ng/ml）；④高浓度用药组（150 ng/ml）。每天观察培养箱中细胞生长状态及数量，显微镜下观察是否污染，如果无污染，当细胞生长状态良好且平铺培养瓶超过80%时，进行传代处理。将细胞静置于37℃条件下，含5%的 CO2细胞培养箱中培养。
1.2.2.2 细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8） 在96 孔板铺板，细胞贴壁后，加不同浓度的药物，在24、36、48 h 往孔里加CCK-8，孵育后测吸光度值。
1.2.2.3 Transwell 上下两个小室，上室种细胞和无血清培养液，下室加10%血清培养液和药物，24 h以后，结晶紫染色，观察细胞穿过上室的数量，判断药物对细胞迁移率的影响。
1.2.2.4 细胞划痕 先在6 孔板铺好细胞，待细胞长满以后，一个培养孔划三条直线，在显微镜下拍照记录线的宽度。再在培养液里加入药物，12 及24 h 后，在显微镜下拍照观察直线的宽度变化。
1.3 统计学分析
使用 Graphpad Prism 软件分析，采用t检验分析，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 动物实验结果
2.1.1 Western blot 检测结果 大鼠成瘤后，检测各组核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），磷酸化核因子κB（phosphorylation nuclear factor kappa-B，pNF-κB），以及PTEN 三种蛋白的表达。结果为各组中NF-κB 蛋白的表达量由高到低分别是：纳米用药组、普通用药组、癌旁组织组、生理盐水组，且生理盐水组肿瘤组织中的NF-κB 蛋白含量明显低于癌旁组织组；纳米用药组的PTEN 蛋白表达高于普通用药组和生理盐水组。见图1。
图1 Western blot 检测不同用药组大鼠肿瘤组织及正常癌旁组织内各通路蛋白活化情况
2.1.2 PCR 检测结果 本研究通过PCR 检测不同用药组，小鼠肿瘤组织中mir-221 的量，PCR 结果显示纳米用药组中的mir-221 含量低于普通用药组和生理盐水组。见图2。
图2 PCR 检测不同用药组肿瘤组织内mir-221 的表达水平
2.2 细胞实验结果
2.2.1 CCK-8 检测结果 通过CCK-8 实验测量雷公藤甲素对C6 细胞的半抑制浓度，得出24 h 的半抑制浓度约为55 ng/ml。且随着药物作用时间延长及药物浓度的增加，细胞存活率逐渐下降。见图3。
图3 CCK8 检测胶质瘤C6 细胞存活率在不同作用时间下随雷公藤甲素浓度的变化情况
2.2.2 Transwell 检测结果 Transwell 细胞迁移实验发现，雷公藤甲素对C6 细胞的迁移有明显的抑制作用，特别是中浓度组和高浓度组。见图4。
图4 Transwell 检测不同浓度雷公藤甲素对胶质瘤C6 细胞迁移的影响
2.2.3 划痕实验检测结果 细胞划痕实验，发现雷公藤甲素对C6 细胞的迁移在高浓度组有明显的抑制作用，但中浓度和高浓度之间虽有差异但差异无统计学意义。见图5。
图5 划痕实验检测不同浓度雷公藤甲素对胶质瘤C6 细胞迁移的影响
2.2.4 PCR 检测结果 雷公藤甲素同样对miR-221的表达量有抑制作用。并且随着药物浓度的增加，mir-221 的相对表达量逐渐减少，且具有统计学意义（P＜ 0.05）。见图6。
图6 PCR 检测不同浓度雷公藤甲素作用下，胶质瘤C6 细胞内mir-221 的表达情况
3 讨论
胶质瘤是起源于胶质细胞常见的脑肿瘤，是原发性侵袭性脑肿瘤，流行病学上，胶质瘤发生在所有年龄段，更常见于成人，男性比女性更易患本病。胶质瘤患者预后严重不良，病死率很高，由于复发率高，且对放射治疗和化学药物治疗有抵抗力，平均生存时间少于15 个月。所以基于生物标志物准确识别胶质瘤对胶质瘤患者的预后和个性化治疗具有重要意义[10-13]。那么，研究胶质瘤发生和发展的机制以及寻找更好的给药方式具有重要的现实意义[14]。
近年来，由于中药治疗有助于患者恢复，提高自身的抗癌能力，减少肿瘤的再复发和再转移，提高生存率等原因，一些具有靶向治疗的中药在肿瘤的治疗中已经得到广泛应用[15-16]。其中，雷公藤作为中国的传统中药，具有活血通络、清热解毒等作用，目前其药品制剂已广泛应用于临床，而雷公藤甲素是其发挥作用的基本成分。其在乳腺癌中，雷公藤甲素的抗侵袭作用与抑制细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein Kinases，ERK）信号传导和NF-κB 及激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）激活有关[17]；在甲状腺癌中，雷公藤甲素可以通过抑制细胞增殖、诱导凋亡和抑制炎症途径来治疗甲状腺癌[18]；在肺癌中，雷公藤甲素对肺癌细胞具有放射治疗增敏作用，其主要机制可能与其参与细胞凋亡及周期调控有关[19]；在非小细胞癌肺癌中，雷公藤甲素可通过抑制p21 活化激酶4（p-21-activated kinase 4，PAK4）信号通路抑制非小细胞癌细胞增殖和转移，并促进其凋亡[20]；在子宫内膜癌中，雷公藤甲素通过诱导子宫内膜癌细胞DNA 损伤促进细胞凋亡，发挥抑癌作用[21]；在恶性黑色素瘤中，雷公藤甲素通过上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）通路抑制恶性黑色素瘤细胞的增殖及侵袭[22]。而大部分中药抗肿瘤活性成分往往水溶性差、生物利用度低等，限制了其临床应用。与游离药物相比，纳米载药系统表现出改善的生物利用度、增强了组织靶向性、减轻了脱靶不良反应及更大的体内稳定性。
因此，本研究拟于在纳米给药的基础上，体内实验和体外实验两个水平来探究雷公藤甲素对胶质瘤的治疗作用机制是否通过抑制mir-221 的表达，从而抑制胶质瘤细胞增殖及侵袭。
本研究中Transwell 细胞迁移实验，发现雷公藤甲素对C6 细胞的迁移有明显的抑制作用，特别是中浓度组和高浓度组；细胞划痕实验结果和Transwell 细胞迁移实验得出的结论一致；Western检测结果为各组中NF-κB 蛋白的表达量由高到低分别是：纳米用药组、普通用药组、癌旁组织组、生理盐水组，纳米用药组的PTEN 蛋白表达高于普通用药组和生理盐水组；实时定量PCR 技术检测发现，雷公藤甲素对mir-221 的表达量有抑制作用。
综上，本研究说明雷公藤甲素可能时通过抑制NF-κB 的磷酸化从而减少mir-221 的激活进而上调抑癌基因PTEN 蛋白的表达发挥作用，而且雷公藤甲素制备成纳米剂型的效果可能更好。此外，雷公藤甲素可以抑制C6 细胞的迁移以及mir-221 的相对表达，可能为胶质瘤诊断与治疗提供有效的标记物，为研究胶质瘤细胞增殖及侵袭的作用机制提供有力的理论依据。
