不同光照强度对不同品种银杏黄酮积累的影响1)

赵群 赵慧琴 王改萍 周伟伟 章雷

(南京林业大学,南京,210037)

银杏(Ginkgobiloba)是我国特有的珍贵孑遗植物,具有很好的观赏价值和药用价值[1]。银杏叶提取物中黄酮类化合物是主要的药用成分,包括槲皮素、山奈酚、异鼠李素[2],具有清除自由基、抗氧化、降血脂、降血糖等作用,在治疗冠心病、糖尿病、心脑血管疾病等方面有较好的效果[3]。我国在银杏药源方面拥有着得天独厚的优势,但是我国银杏叶提取物的质量标准还与欧美国家存在一定的差距[4],因此培育出黄酮质量分数高的银杏品种和改进银杏培育技术尤为重要。

类黄酮是植物体内最重要的次生代谢物之一,在植物的生长、发育、抗逆性等方面发挥着重要的作用[5]。苯丙氨酸代谢途径是植物类黄酮生物合成的起始途径,苯丙氨酸酶(PAL)、肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)是苯丙氨酸代谢途径的关键酶,对黄酮前体物质的合成起着关键作用[6]。光照[7]、温度[8]、水分[9]等环境条件的变化,都会刺激植体内的防御机制,从而引起黄酮质量分数的改变。光照是植物进行光合作用获得生长所需能量的来源,对植物的生长发育、形态建成、物质代谢至关重要[10]。植物通过光合作用产生营养物质,而这些营养物质是黄酮类次生代谢物合成的基础[11]。王华田等[12]研究表明,树冠上层受到光照较强的银杏叶片的黄酮质量分数,明显高于下层光照不足的叶片;也有不少研究发现,适度的遮阴也可以促进黄酮质量分数的积累[13]。所以探究光照强度对银杏黄酮积累的影响具有重要意义。

为此,本研究在河北省唐山市滦南县林场,以3年生银杏实生苗为砧木,以优株枝条为接穗(6个品系)进行嫁接;在植株上方、距地面高2 m,搭建2种不同透光度的遮阴网(遮光率为25%、45%的遮阴),以不遮阴作为对照;以6个品系的3年生银杏嫁接苗为试验材料,测定净光合速率、酶活性、次生代谢物、总黄酮醇苷,分析不同遮阴处理对6个银杏品系叶净光合速率、酶活性、总黄酮质量分数的影响,遴选有利于银杏黄酮积累的最适光照强度、最优银杏品系。旨在为叶用银杏的经营管理提供参考。

1 试验地概况

试验地为河北省唐山市滦南县林场(地理坐标:东经118°8′～118°53′、北纬39°～39°38′),属暖温带半湿润大陆性季风性气候。年平均气温10.6 ℃,常年降水量658 mm,年均日照时间2 853 h,无霜期186 d。主要土壤类型为草甸褐土、水稻土、潮土、风沙土等;土壤pH为6.2～7.5,有机质质量分数约13.3 g·kg-1,土壤墒情好、肥力较高、保水保肥能力强。

2 研究方法

以高0.5～0.8 m、地径(1.5±0.2)cm的银杏3年生实生苗(邳州的梅核品种)为砧木,以直径(1.0±0.1)cm的优株枝条为接穗进行嫁接,接穗包括6个品系:13#(产地为江苏农学院)、16#(产地为江苏农学院)、27#(产地为铁富南冯场)、叶丰(产地为山东日照)、大花穗(产地为江苏邳州)、泰兴大佛指(产地为江苏泰兴),每个无性系各嫁接60～90株,每根砧木嫁接1根接穗。

试验在2021年6月下旬开始,9月下旬结束。采用随机区组试验设计,共设3个区组,作为试验的3个重复,每个区组包括6个小区,6个银杏品系随机分配在各小区。在每个小区的植株上方搭建两种不同透光度的遮阴网,遮阴网距地面2 m;用手持式光量子计3415F测得遮光率分别为遮光率为25%遮阴、遮光率为45%遮阴,以不遮阴作为对照。试验设3个重复,每个重复包括20株苗木。

叶片光合作用指数的测定:于上午9时到11时,在每个区组随机选取18植株银杏嫁接苗,采用Li-6400便携式光合测定仪(LI-COR公司,美国)测定光合参数,重复3次。

苯丙氨酸酶(PAL)活性测定:参考刘家尧等[14]的方法,并适当改进。取新鲜叶片0.2 g,加入浓度为0.05 mol/L、pH为8.8的硼酸缓冲液(含巯基乙醇5 mmol/L)6 mL,少量聚乙烯吡烷酮(PVP),在冰浴中研磨匀浆,于4 ℃、10 000 r/min离心15 min,取上清液测定酶活力。反应液包括上清液0.2 mL、浓度为0.02 mol/L的苯丙氨酸1 mL、浓度为0.05 mol/L的硼酸缓冲液3.8 mL,总体积5 mL。对照不加酶液,以硼酸缓冲液代替。混匀后,恒温水浴(30 ℃)反应30 min,加入浓度为6 mol/L的盐酸溶液0.5 mL终止反应。在波长290 nm处测定吸光度值,以每小时吸光度值变化0.1为1个酶活单位(U)。

肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)活性测定:参考陈雷等[15]方法,并适当改进。取新鲜叶片0.2 g,加入5 mL预冷(4 ℃)的浓度为0.1 mol/L、pH为7.6的磷酸缓冲液(含蔗糖0.25 mol/L、乙二胺四乙酸0.5 mmol/L、巯基乙醇2 mmol/L),冰浴迅速研磨成匀浆,于4 ℃、12 000 r/min离心30 min,上清液用于酶活性的检测。测定系统含有酶液0.2 mL、浓度为50 mmol/L的肉桂酸0.2 mL、质量浓度为0.4 g/L的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸3 mL、浓度为0.1 mol/L的磷酸缓冲液3 mL。对照不加酶液,以磷酸缓冲液代替。反应液水浴(30 ℃)30 min,加入0.2 mL浓度为6 mol/L的盐酸终止反应,取上清液用NaOH调至pH为11;在波长340 nm处测定吸光度,以每分钟吸光度值变化0.01为1个酶活单位(U)。

叶片黄酮质量分数测定:参照《中国药典》[16]方法,利用waters1525分析型高效液相色谱仪测定。

总黄酮醇苷的质量分数=(槲皮素质量分数+山柰酚质量分数+异鼠李素质量分数)×2.51。式中的2.51,为总黄酮醇苷与其水解后的三种苷元槲皮素、山柰酚、异鼠李素的换算系数。

数据处理:使用Excel对数据进行统计,并用SPSS 24.0软件中的邓肯(Duncan)法进行方差分析、相关性分析。

3 结果与分析

3.1 光照强度对银杏光合作用的影响

由表1可见:净光合速率在不同光照强度时存在一定的差异,而不同品种(系)间差异不显著。16#品系在不同光照强度处理间净光合速率差异显著(P<0.05);其他品系的净光合速率,在不同光照强度处理间差异不显著。27#在对照(不遮阴)时净光合速率最高(7.23 μmol·m-2·s-1),大花穗在遮光率为45%时净光合速率最低(3.8 μmol·m-2·s-1)。不同银杏品系净光合速率,由大到小均呈现对照(不遮阴)、遮光率为25%、遮光率为45%的趋势,表明随着光照强度的降低,银杏净光合速率下降。

表1 不同光照强度时各品种(系)银杏净光合速率

3.2 光照强度对银杏苯丙烷代谢酶活性的影响

光照强度、品种(系)以及两者的协同效应,对银杏苯丙氨酸酶活性都存在显著影响;随着光照强度的降低,苯丙氨酸酶活性呈现先升高后降低的趋势(见表2)。同一光照强度时,不同品种(系)间银杏苯丙氨酸酶活性差异极显著(P<0.01);在对照(不遮阴)、遮光率为45%遮阴处理时,叶丰的苯丙氨酸酶活性明显大于其他5个品种(系);在遮光率为25%遮阴处理时,泰兴大佛指苯丙氨酸酶活性最大(15.79 U·g-1);而在遮光率为45%遮阴处理时,13#苯丙氨酸酶活性最低(3.29 U·g-1)。在不同光照强度间,除了叶丰外的其他品种(系)苯丙氨酸酶活性都存在显著差异(P<0.05);其他品种(系)在遮光率为25%遮阴处理时的苯丙氨酸酶活性,显著高于对照(不遮阴)、遮光率为45%遮阴处理时的苯丙氨酸酶活性,说明遮光率为25%遮阴处理可以显著提高叶片苯丙氨酸酶活性。

表2 不同光照强度时各品种(系)银杏苯丙氨酸酶活性

光照强度、品种(系)及两者的协同效应,对银杏肉桂酸-4-羟基化酶的活性都存在显著影响。由表3可见:同一光照强度时,不同品种(系)间银杏肉桂酸-4-羟基化酶活性差异显著(P<0.05);在遮光率为25%遮阴处理时,泰兴大佛指肉桂酸-4-羟基化酶活性最大(43.80 U·g-1);在对照(不遮阴)时,13#肉桂酸-4-羟基化酶活性最低(16.77 U·g-1)。13#和叶丰在不同光照强度间肉桂酸-4-羟基化酶活性差异显著(P<0.05);13#和叶丰在遮光率为25%、45%遮阴处理时的肉桂酸-4-羟基化酶酶活性,明显大于对照(不遮阴)时的肉桂酸-4-羟基化酶活性。说明在银杏生长过程中,通过遮光率为25%、45%的遮阴处理,可以显著提高银杏叶片肉桂酸-4-羟基化酶活性。

表3 不同光照强度时各品种(系)银杏肉桂酸-4-羟基化酶活性

3.3 光照强度对银杏次生代谢物质量分数的影响

由表4可见:随着光照强度降低,银杏黄酮醇质量分数总体都呈现先上升后下降的趋势。①不同光照强度时,除了27#以外的其他品种(系)银杏槲皮素质量分数都存在显著差异(P<0.05);遮光率为25%遮阴处理时,叶丰槲皮素质量分数最高(2.54 mg·g-1);13#、16#在遮阴处理时的槲皮素质量分数,显著高于对照(不遮阴)时的槲皮素质量分数;大花穗、泰兴大佛指、叶丰在遮光率为25%遮阴处理时的槲皮素质量分数,显著高于对照(不遮阴)、遮光率为45%遮阴处理时的槲皮素质量分数;只有27#槲皮素质量分数差异不显著。②不同光照强度时,13#和泰兴大佛指山奈酚质量分数存在极显著差异(P<0.01),在遮光率为25%遮阴处理时的山奈酚质量分数,显著高于对照(不遮阴)、遮光率为45%遮阴处理时的山奈酚质量分数。大花穗和叶丰质量分数差异显著(P<0.05);遮光率为25%遮阴处理时,叶丰的山奈酚质量分数最高(1.49 mg·g-1);大花穗在遮阴处理时的山奈酚质量分数,显著高于对照(不遮阴)时的山奈酚质量分数;只有16#、27#品系山奈酚质量分数差异不显著。③不同光照强度时,13#和泰兴大佛指银杏异鼠李素质量分数都存在显著差异(P<0.05);遮光率为25%遮阴处理时,泰兴大佛指异鼠李素质量分数最高(0.76 mg·g-1);13#在遮阴处理时的异鼠李素质量分数,明显大于对照(不遮阴)的异鼠李素质量分数;泰兴大佛指在遮光率为25%遮阴处理时的异鼠李素质量分数,明显大于对照(不遮阴)、遮光率为45%遮阴处理时的异鼠李素质量分数;只有27#异鼠李素质量分数差异不显著。④综合试验结果,适度地遮阴可以显著提高叶片黄酮醇质量分数,总体看遮光率为25%遮阴处理效果最佳。

表4 不同光照强度时各品种(系)银杏嫁接苗的黄酮醇积累量

光照强度、品种(系)及两者的协同效应,对银杏总黄酮醇苷质量分数都存在显著影响。由表5可见:同一光照强度时,不同品种(系)间银杏总黄酮醇苷质量分数差异极显著(P<0.01);遮光率为25%遮阴处理时,泰兴大佛指总黄酮醇苷质量分数最高(11.28 mg·g-1);对照(不遮阴)时,16#总黄酮醇苷质量分数最低(3.49 mg·g-1)。在不同光照强度时,除了27#以外的其他品种(系)银杏总黄酮醇苷质量分数都存在显著差异(P<0.05);13#、泰兴大佛指、叶丰在遮光率为25%遮阴处理时总黄酮醇苷质量分数,明显高于对照(不遮阴)、遮光率为45%遮阴处理时总黄酮醇苷质量分数;16#、大花穗在遮阴处理时总黄酮醇苷质量分数,明显高于对照(不遮阴)时总黄酮醇苷质量分数;只有27#总黄酮醇苷质量分数差异不显著;综合试验结果,遮光率为25%遮阴处理可显著提高银杏叶总黄酮醇苷质量分数。

表5 不同光照强度时各品种(系)银杏总黄酮醇苷质量分数

3.4 不同光照强度时银杏生理指标相关性

由表6可见:银杏净光合速率与其他指标无明显相关性;而苯丙氨酸酶、肉桂酸-4-羟基化酶活性,与总黄酮醇苷质量分数呈显著正相关,说明随着苯丙氨酸酶、肉桂酸-4-羟基化酶活性的增加,总黄酮醇苷质量分数也逐渐增加。苯丙氨酸酶与肉桂酸-4-羟基化酶之间,也呈现显著正相关。

表6 银杏各生理指标间的相关性

4 讨论与结论

光合作用对植物的生长发育起着重要作用,光照强度的变化对银杏叶的光合指标有一定的影响[17]。随着光照强度的降低,银杏叶片光合能力显著下降,不能够进行有效的光合作用,从而导致银杏的生长受到抑制[18]。苑景淇等[19]研究表明,随着遮阴度增加,朝鲜崖柏(Thujakoraiensis)的净光合速率降低。张往祥等[20]研究表明,遮阴可以降低银杏的光合午休程度,从而导致净光合速率的降低。本研究中,银杏净光合速率随着遮阴强度的增加而呈下降趋势,除了16#外,其他品系在不同光照强度时净光合速率差异都不显著,是因为这些品系在一定的光照条件时光合作用已达到饱和,从而导致净光合速率与苯丙氨酸酶活性、肉桂酸-4-羟基化酶活性、黄酮质量分数间没有显著相关性。

苯丙氨酸酶、肉桂酸-4-羟基化酶是次生代谢途径中的关键酶,对黄酮的合成有重要的促进作用[21]。不同的光照强度对苯丙氨酸酶活性、肉桂酸-4-羟基化酶活性都存在显著影响。本研究表明,遮光率为25%遮阴处理时苯丙氨酸酶活性最高,肉桂酸-4-羟基化酶活性在遮阴处理时显著高于不遮阴处理时。Pacheco et al.[22]研究表明,遮阴处理时,树胡椒(PiperaduncumL.))叶片中苯丙氨酸酶活性是全光照下的2.5倍,说明适度的遮阴能有效提高酶活性。而朱灿灿[23]研究表明,不同光强条件时苯丙氨酸酶、肉桂酸-4-羟基化酶的变化趋势一致,且随着光照强度的减弱,两种酶活性呈现逐渐减小的状态;这是因为品种不同导致的,不同品种间生物学特性不同,处理时间和试验地自然条件也不同,从而会影响试验结果。本研究中,泰兴大佛指在遮光率为25%遮阴处理时苯丙氨酸酶、肉桂酸-4-羟基化酶活性都达到最高,说明遮光率为25%遮阴处理对泰兴大佛指酶活性的效果最好。

光照强度对银杏次生代谢途径有重要的影响,光合作用能使银杏叶片中黄酮类化合物得到有效的积累[24]。遮阴能够有效降低叶片的温度,有利于黄酮类化合物的积累[25]。钱龙梁等[26]研究表明,银杏叶的总黄酮质量分数在30%遮阴处理时最高。文献[26]和本研究试验结果出现差异的原因,主要是由于遮阴方式不同,文献[26]是通过玉米植株形成的阴影对1年生银杏幼苗进行生物遮阴,而本研究试验使用的不同透光度的遮阴网,文献[26]遮阴方式比较粗放;而且银杏苗龄不同,黄酮质量分数也会有很大的差异。王华田等[27]研究表明,存在1个最适宜的光照强度42%使得银杏叶片的黄酮质量分数最高;与本研究试验结果存在差异的主要原因是测定黄酮的方法不同以及品种的差异;文献[27]是采用分光光度法直接测定3年生银杏实生苗总黄酮质量分数,而本研究试验采用高效液相色谱法(HPLC)测定3年生银杏嫁接苗每一个黄酮醇苷质量分数再计算总黄酮醇苷质量分数。冷平生等[28]研究表明,自然光下黄酮质量分数最高,是遮阴时间以及苗龄与本试验不同造成的。

本研究相关性分析表明,肉桂酸-4-羟基化酶、苯丙氨酸酶活性呈显著正相关;苯丙氨酸酶、肉桂酸-4-羟基化酶活性,与总黄酮质量分数呈显著正相关。苯丙氨酸酶能够催化苯丙氨酸生成银杏次生代谢产物的前体物质肉桂酸[29];肉桂酸-4-羟基化酶作用于苯丙烷代谢途径中的第二步,能催化反式肉桂酸转化为对香豆酸[30];苯丙氨酸酶、肉桂酸-4-羟基化酶是银杏苯丙烷代谢途径中的关键酶,而苯丙烷代谢途径是合成黄酮类化合物的起始途径[31];因此,苯丙氨酸酶活性的变化会引起肉桂酸-4-羟基化酶活性的变化,进而引起黄酮质量分数的变化。

本研究综合分析表明,轻度遮阴对银杏黄酮积累有利,以遮光率为25%遮阴处理效果最佳。在这个遮阴强度时,虽然净光合速率有一定程度的降低,但是银杏苯丙氨酸酶活性、肉桂酸-4-羟基化酶活性、总黄酮醇苷质量分数较高;不同品系在遮阴处理时也存在较大差异,以泰兴大佛指表现最好,27#表现最差。泰兴大佛指在遮光率为25%遮阴处理时,苯丙氨酸酶活性、肉桂酸-4-羟基化酶活性、总黄酮醇苷质量分数最高。因此,泰兴大佛指适合作为叶用品种(系)在唐山地区栽培,在高温强光的夏季可以通过遮光率为25%遮阴处理进一步提高黄酮质量分数,以更好地发挥银杏的药用价值。