可注射性富血小板纤维蛋白混合软骨颗粒制备支撑移植物实验研究

马泽坤, 侯团结, 陈 啸, 李平松

(1. 扬州大学医学院, 江苏 扬州, 225009;2. 江苏省苏北人民医院 烧伤整形科-医学美容科, 江苏 扬州, 225009)

鼻整形手术能够明显改善面部轮廓和增强面部立体感,已成为整形手术中极为常见的项目之一。人工材料作为鼻整形手术主要的支撑移植物,可引起不同程度的排异反应、感染、移位,甚至发生假体外露等情况。1941年经YOUNG F[1]首次报道后,颗粒软骨被广泛应用于鼻整形手术中[2-6]。但是单纯的软骨颗粒移植存在吸收率高、生存能力差问题,且由于缺乏固定,散在的软骨颗粒在结构稳定性、外观流畅性等方面有所欠缺,严重影响了手术效果。可注射性富血小板纤维蛋白(i-PRF)作为新一代血小板浓缩物,在促进软骨细胞增殖分化方面效果确切,对术后炎症过程具有积极影响[7]。此外,作为一种液-固形态转换的血小板浓缩物, i-PRF混合软骨后能减小软骨颗粒的移动度,使其在支撑物中的位置更为固定。本研究将高密度多孔聚乙烯(HPDE)材料作为提供支撑力的移植物基底,用混合i-PRF的软骨颗粒覆盖HPDE材料形成软骨支撑移植物在动物皮下进行体内实验,以期减少材料直接接触皮肤组织所致排异、外露等情况,并与单纯软骨颗粒覆盖人工材料所得移植物的效果进行比较,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级成年新西兰白兔9只,平均体质量2.5 kg, 均由南京市浦口区莱芙养殖场提供,许可证号SCXK(苏)2019-0005。实验过程中对动物的处置措施均符合2006年国家科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 实验材料与仪器

HPDE材料舒铂(Su-por, 型号4008, 厚度0.85 mm, 规格3.8 cm×5.0 cm), 购自美国Poriferous公司; SA1020-小鼠/兔IgG SABC免疫组化染色试剂盒(博士德公司); 兔Ⅱ型胶原多克隆抗体(Proteintech, 美国); DAB显色试剂盒(博士德公司); 免疫荧光染色试剂盒-抗兔AF594(伊莱瑞特公司); CD31抗体(Affinity, 美国); 改良Masson三色染色试剂盒(索莱宝公司); 改良番红O-固绿软骨染色试剂盒(索莱宝公司); 扫描电子显微镜(HITACHI, 日本); 倒置相差显微镜(ZEISS, 德国)。

1.3 实验方法

i-PRF制备: 分别在无菌条件下对白兔进行心脏取血10 mL至不含抗凝剂的真空负压管中,立即于离心机中以700转/min离心3 min, 全血分为2层,上层黄色清亮液体即i-PRF, 取出备用。

软骨颗粒制备: 分别在无菌条件下取白兔耳软骨,剥离下表皮及皮下纤维软组织,露出光滑软骨,先后置于含2%双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)和不含双抗的PBS中清洗3～5 min, 用无菌手术刀将软骨切割成1～2 mm3颗粒备用。对白兔耳部创缘进行清洗消毒,并加压包扎。

人工材料准备: 将HPDE材料修剪为边长1.5 cm的方形材料备用。

支撑移植物制备: 将支撑移植物分为4组,即A组(单纯HPDE材料组,n=9)、B组(i-PRF+HPDE材料组,n=9)、C组(软骨颗粒+HPDE材料组,n=9)和D组(i-PRF+软骨颗粒+HPDE材料组,n=9)。A组仅HPDE材料, B组是将1 mL i-PRF直接均匀覆盖于HPDE材料上, C组是将相同大小的20块软骨颗粒直接平铺于HPDE材料上, D组是将1 mL i-PRF与20块软骨颗粒混合后再均匀铺于HPDE材料上,i-PRF约15 min凝固,呈胶状混合软骨颗粒。4组移植物所用HPDE材料的大小、形状均一致,边长约为1.5 cm。

动物体内实验: 以3%戊巴比妥(30 mg/kg)经耳缘静脉注射麻醉,将白兔伸膝位俯卧固定,备皮消毒,手术区域铺巾。将每只白兔取背部上下左右共4个位置分别做长约1.5 cm的横行切口,用眼科剪钝性分离皮下组积,再将4组各1个移植物埋入对应白兔已分离好的皮下组织中。用生埋盐水清洗后缝合手术切口,完成体内实验,术后单笼饲养。

组织切片获取: 将9只实验白兔按随机数字表法分为3个观察批次(每个批次3只),分别于术后4、8、12周时取出各组移植物。

组织学观察方法: ① 肉眼观察,取出4组移植物后进行肉眼观察,观察各组移植物表面组织生长被覆情况。② 电镜观察,将获得的D组移植物固定至2.5%戊二醛固定液4 ℃过夜后于电镜下观察,观察人工材料内部显微结构和软骨颗粒、组织在材料中长入情况。③ 苏木素-伊红(HE)染色法,将切片常规脱蜡至水,以苏木素浸染3～5 min, 分化液中分化2～3 s, 反蓝液中反蓝5～10 s, 85%乙醇脱水,伊红浸染,最后脱水,透明,封片,于光镜下观察各组人工材料上被覆组织(软骨颗粒、纤维组织等)的生长情况。④ 番红O-固绿染色法,按照改良番红O-固绿软骨染色试剂盒说明书流程进行操作,对C组和D组中的软骨颗粒进行特异性染色,观察其生长情况。由于A组和B组中不含软骨颗粒,该染色法中未纳入A组和B组。⑤ Ⅱ型胶原免疫组化法,按照SA1020-小鼠/兔IgG SABC免疫组化染色试剂盒说明书流程进行操作,对C组和D组软骨中的Ⅱ型胶原进行染色,观察软骨颗粒的生长情况。由于A组和B组中不含软骨颗粒,该染色法中未纳入A组和B组。⑥ Masson染色法,按照改良Masson三色染色试剂盒说明书流程进行操作,对A组和B组中的胶原纤维进行染色,观察其长入人工材料的情况。由于C组和D组中有软骨颗粒,会影响对其空隙中胶原纤维的染色及观察,该染色法中未纳入C组和D组。⑦ CD31免疫荧光法,按照免疫荧光染色试剂盒-抗兔AF594说明书流程进行操作,对A组和B组中的血管内皮进行染色,观察新生血管长入人工材料的情况。由于C组和D组中有软骨颗粒,会影响对其空隙中新生血管的染色及观察,该染色法中未纳入C组和D组。

2 结 果

2.1 移植物肉眼观察结果

术后12周时,取出各组移植物后进行肉眼观察。观察结果显示, 4组移植物表面均有纤维血管包被,说明组织能够包绕移植物进行生长; 相较于A组,B组材料表面的纤维血管在肉眼观察下更明显; 相较于C组, D组移植物从皮下取出后软骨颗粒丢失较少,较为稳定地固定于材料上,且表面纤维血管更丰富; C组软骨颗粒部分缺失,皮下包埋过程中移动损失较多,表面组织血管较D组匮乏。见图1。

A: A组移植物典型图; B: B组移植物典型图; C: C组移植物典型图; D: D组移植物典型图。

2.2 电镜观察结果

电镜扫描结果显示,该HPDE材料为疏松多孔结构,孔隙之间相互贯通,见图2A。术后4周时D组移植物电镜扫描结果显示,纤维血管等软组织包裹着HPDE材料及附着其上的软骨颗粒,且支撑移植物的孔隙中有纤维血管长入,见图2B、图2C。

A: 新型HPDE材料电镜扫描图; B: 术后4周时D组移植物电镜纵向扫描图(典型图);C: 术后4周时D组移植物电镜横向扫描图(典型图)。

2.3 HE染色法观察结果

术后4周时, C组软骨颗粒的边缘有再生趋势,有横形排列的梭形的成软骨细胞及新生软骨细胞,软骨颗粒之间界限清晰,切缘平整; D组软骨颗粒边缘部分新生软骨细胞已增殖形成同源细胞群,向软骨外附加性生长,软骨颗粒边缘较平整,较少数切缘由于局部软骨细胞增殖较快而形成凸起。术后8周时, C组部分细胞处于成熟期,靠近颗粒尖端处细胞增殖较明显,呈现互相连接的趋势,大部分颗粒切缘清晰,但存在多处细胞增殖形成的凸起; D组较多软骨细胞处于成熟期,大部分边缘的细胞以及部分处于颗粒内部的软骨细胞增殖形成同源细胞群,部分软骨颗粒之间已被增殖的软骨细胞填充连接,切缘由于软骨细胞生长而失去平整性。术后12周时,C组软骨颗粒同时存在边缘的附加性生长和内部的间质性生长,部分颗粒切缘由于软骨增殖及与相邻软骨连接而已消失; D组软骨颗粒之间基本相互连接,边界消失,提示含有i-PRF的移植物软骨颗粒之间能更快连接成片。B组和A组HPDE材料孔径内均有纤维血管长入,且2组术后12周时组织长入明显比术后4周时丰富,但A组术后4、8、12周时组织量均比同时期B组少,长势不如B组。见图3。

A、B、C: A组术后4、8、12周时的光镜下典型图; D、E、F: B组术后4、8、12周时的光镜下典型图;

2.4 番红O-固绿染色法观察结果

术后4周时, C组边界较清晰平整,边缘处未被番红O着色, D组的部分软骨颗粒边缘有横行的红色淡染区,与HE染色中新生软骨细胞情况一致,说明有新生软骨细胞向边缘长出。术后8周时, C组的部分软骨颗粒连接处同样有番红O着色,但染色较淡, D组的部分软骨颗粒连接处为红色,已被新生的软骨细胞填充。术后12周时,C组多数软骨颗粒之间已被番红O染色,但部分颗粒边界尚清, D组番红O染色几乎连接成片,颗粒染色边界不清晰。见图4。

A、B、C: C组术后4、8、12周时的光镜下典型图; D、E、F: D组术后4、8、12周时的光镜下典型图。

2.5 Ⅱ型胶原免疫组化法观察结果

Ⅱ型胶原分布情况显示, C组的软骨颗粒在术后4周时边界较清楚,术后12周时衔接变紧密,但效果不如D组; 随着时间的推移, D组软骨颗粒之间衔接变紧密,术后12周时基本连接成片。见图5。

A、B、C: C组术后4、8、12周时的光镜下典型图; D、E、F: D组术后4、8、12周时的光镜下典型图。

2.6 Masson染色法观察结果

术后4周时, A组有少量胶原纤维长入材料孔隙内,B组则多于A组; 术后8周时,A组材料孔隙内胶原纤维含量增加, B组胶原纤维含量亦增加,且总体含量多于A组; 术后12周时, A组与B组的胶原纤维含量均增加,且B组胶原纤维含量高于A组。见图6。

A、B、C: A组术后4、8、12周的光镜下典型图; D、E、F: B组术后4、8、12周时的光镜下典型图。

2.7 CD31免疫荧光法观察结果

术后4周时, B组和A组材料孔隙内均有新生血管形成,但血管密度较低; 术后8周时, B组和A组血管密度均升高; 术后12周时, B组和A组血管密度均更高; B组不同时点的新生血管密度均高于A组,即B组新生血管长势更快。见图7。

A、B、C: A组术后4、8、12周时的光镜下典型图; D、E、F: B组术后4、8、12周时的光镜下典型图。

3 讨 论

本研究探讨了i-PRF混合软骨颗粒覆盖HPDE制备复合软骨支撑移植物的方法,结果显示, i-PRF混合软骨颗粒覆盖于新型HPDE材料所形成的复合软骨支撑移植物的细胞增殖及血管化能力较强,同时软骨颗粒固定较好,更符合临床需求,可为临床手术治疗提供新的选择。本研究不仅分析了i-PRF的加入对移植物中软骨颗粒的影响,还分析了i-PRF的加入对移植物中纤维和血管包裹与长入人工材料的影响,由于颗粒软骨的存在会一定程度上影响对纤维和血管组织学形态的观察,本研究另行设立无软骨颗粒的单纯HPDE材料组(A组)和i-PRF+HPDE材料组(B组),以便更直观地观察组织形态。

本研究中, D组以新型HPDE材料舒铂为支架并铺垫为基底,将颗粒软骨与i-PRF混合后覆盖其表面,能有效减少人工材料与软组织直接接触而引起的并发症。人工材料从最初的硅胶到膨体再到Medpor、新型HPDE材料等,性能已不断改进[8-13]。但即便如此,作为非自体物质,这些材料被植入人体组织后,仍可能引发感染、变形、排异甚至材料外露等风险[11, 14]。舒铂是由HPDE材料高温高压压合制成的生物材料,有足够的硬度辅助构建鼻下端力学结构,能为移植物提供良好的力学支撑[15], 其内部为疏松多孔结构,孔径约200 μm且孔隙率占整体材料的50%,更适应人体组织的良好血管化生长,易重建血液循环,增加生物相容性。将i-PRF与软骨颗粒混合后覆盖于HPDE材料表面,液-固态转换的i-PRF可对软骨颗粒起到位置固定作用,使其更好地黏附于材料上,避免手术操作中软骨颗粒的大量脱落。更重要的是,单纯的软骨颗粒还存在自行吸收和移位的弊端,故EROL O O[16]曾针对性提出经典的“Trukish”理论,即土耳其软糖模型,而DANIEL R K等[17]曾提出使用筋膜组织包裹软骨颗粒以减少吸收。但有研究[18]发现,比起单纯的散在软骨颗粒,有Trukish或筋膜包裹的软骨颗粒由于覆盖物在软骨与受体组织之间形成屏障,损害了血浆向软骨的扩散能力而使得软骨颗粒生存能力下降。i-PRF则可减少软骨颗粒的吸收,并促进软骨颗粒连接成片,形成一层较为完整的软骨组织。

本研究结果显示,含有i-PRF的复合软骨支撑移植物中,软骨颗粒生长较快,能更快连接成片; 含有i-PRF的移植物胶原纤维和新生血管能够更多地覆盖材料表面及长入材料空隙中,为软骨颗粒提供了良好的生长环境,从而更快地建立血液循环。同时,由于初期i-PRF的混合,移植物中软骨颗粒更为稳定,减少了散在软骨颗粒的移动,可保持移植物的完整性。i-PRF是继富血小板血浆(PRP)、富血小板纤维蛋白(PRF)后的第3代血小板浓缩物[19],其纤维蛋白网络更加紧密,电镜下可观察到活化的细胞嵌入i-PRF紧密的三维纤维蛋白网络中[20], 相较其他血小板浓缩物,低速离心形成的i-PRF中白细胞、血小板及生长因子含量更高,分布更均匀,这些成分的结合在组织再生中起着重要作用。在体外培养实验中, i-PRF通过上调S0X9、COL2A1、ACAN等软骨形成相关基因的表达,促进软骨细胞的增殖与分化,一系列体内实验显示i-PRF能够促进软骨缺损部位软骨组织再生及与周围健康组织的融合。GODE S等[21]通过鼻整形手术临床试验验证,i-PRF能够降低软骨颗粒的吸收率。另有研究[22-23]发现, i-PRF能够更多地释放表皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)、转化生长因子-β1(TGF-β1)等生长因子以及Ⅰ型胶原蛋白(Col-1), 这些因子有效促进了成纤维细胞的增殖与分化。ZHANG J L等[24]已证实,i-PRF在组织愈合过程中具有潜在的抗炎作用,能够显著削弱巨噬细胞的促炎作用,激活和趋化感染区域周围的树突状细胞。JASMINE S等[25]也提出,i-PRF对细菌及其生物膜均具有明显杀菌活性,在预防术后葡萄球菌感染方面具有应用潜能。这些潜在的抗炎杀菌作用在减少移植手术术后感染、促进软骨及纤维血管生长的同时,可为移植物提供较为适宜的微环境,减少感染、炎症等导致的皮肤破溃、移植物暴露等情况发生。

本研究结果提示了i-PRF-软骨颗粒-人工材料复合软骨支撑移植物的应用可能性,为临床鼻整形手术的开展提供了新的思路。但本研究仍存在不足之处: ① 研究处于动物实验阶段,尚未进行临床试验,故未能获得可信的临床资料; ② 将移植物埋于皮下软组织中,与鼻整形手术中埋于骨组织附近有所不同,尚不明确能否完全模拟鼻部皮下环境; ③ 同样情况下,体积偏小的软骨颗粒存活能力和再生能力更强(资料[26]显示,边长0.5～1.5 mm的软骨颗粒存活能力和稳定性随着边长的增加而增强),但最适形状和体积仍需进一步探索; ④本研究的最长观察期为术后12周,更为长期的软骨生存吸收情况、软骨增殖及骨化情况目前尚未可知,且后期i-PRF对移植物是否有过度血管化情况亦不明确。未来,研究者需针对这些问题进一步深入研究,从而对本研究结论加以验证。