DnaJ热休克蛋白家族成员C9在肺腺癌中的表达及预后价值

王 愿, 李江涛, 姬巧霞, 张 焕, 才虹美, 李义帅

(河北省胸科医院/河北省肺病重点实验室, 1. 肿瘤二科, 2. 呼吸三科, 3. 结核三科,4. 胸外三科, 河北 石家庄, 050000)

非小细胞肺癌发生率约占肺癌总发生率的85%[1]。肺腺癌(LUAD)是最常见的组织学亚型,早期易发生血行转移。目前,虽然靶向治疗和免疫治疗广泛应用于临床,取得了重大进展,但晚期疾病表现、转移、治疗抗性、5年生存率仍不理想。因此,迫切需要开发全新和更持久有效的LUAD治疗方法和新的生物标志物。热休克蛋白(HSPs)家族是机体受各种应激原刺激后产生的一组应激蛋白,又称热应激蛋白,可参与细胞内蛋白质折叠、转运和免疫、凋亡等多个生理功能,在多数肿瘤细胞中表达增高,并参与肿瘤的生长[2]、侵袭、转移[3]、免疫浸润[4]等。DnaJ热休克蛋白家族成员C9(DNAJC9)是HSPs家族中的一员,在细胞增殖、凋亡、分化和免疫应答等方面有重要作用,但其在LUAD发生、发展中的作用尚无相关研究。本研究系统分析DNAJC9在LUAD中的表达及预后价值,可能为LUAD诊断、治疗及预后提供新的靶点或生物标志物。

1 材料与方法

1.1 数据来源及整理

本研究中基因表达数据和临床信息来源于TCGA (https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-gnomics/tcga), 提取535例LUAD和59例邻近肿瘤的正常组织RNAseq测序数据,并结合基因型-组织表达 (GTEx)数据库中正常肺组织样本的数据,增加对照样本的数量。收集临床病理参数,包括年龄、性别、种族、病理分期、TP53突变。利用survival包、pROC包进行生存资料及临床诊断的分析,并用survminer包及ggplot2包进行可视化分析。

1.2 组织标本免疫组化检测

采用免疫组化检测2020年1月—2022年12月河北省胸科医院40例LUAD石蜡包埋的肿瘤标本中DNAJC9蛋白的表达。本研究通过医院伦理委员会批准(批号2021052)。主要试剂: SP-9000试剂盒和DAB(ZLI-9018)试剂均购自中山金桥生物公司, DNAJC9兔单克隆抗体(EPR9856)(浓度1∶200)购自博士德生物公司,苏木素染料购自北京雷根生物公司。免疫组化检测DNAJC9蛋白的表达: 采用甲醛固定新鲜的LUAD及癌旁组织,石蜡包埋,切片、烤片、脱蜡、抗原修复、渗透、封闭等操作,给予一抗(DNAJC9 抗体1∶200)过夜,加入二抗及辣根酶标记链酶卵白素工作液,采用DAB染色,苏木素复染,脱水封片[5]。结果判定: 棕黄色为DNAJC9蛋白阳性染色。染色强度: 无着色计为0分,淡棕色计1分,深棕色计2分; 染色细胞百分比: <5%计0分, 5%～25%计1分, >25%～50%计2分, >50%计3分。2项得分相加为总分,将总分≥2分设为高表达,反之为低表达。由2名病理科医师判定结果。

1.3 DNAJC9与LUAD肿瘤浸润性免疫细胞(TIICs)的关系

通过TIMER数据库 (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)中的Gene模块分析LUAD中DNAJC9表达及其与免疫细胞浸润水平的相关性。TIMER数据库中分析的免疫细胞包括B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞。本研究使用单样本基因集富集分析(ssGSEA)分析了24种肿瘤浸润免疫细胞(TIICs)的免疫反应,以评估LUAD中DNAJC9表达与免疫细胞浸润的相关性。

1.4 DNAJC9和其他基因表达的相关性分析

通过GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)分析在LUAD中DNAJC9与免疫检查点基因表达的相关性。

1.5 DNAJC9甲基化分析

利用UALCAN数据库(http://UALCAN.path.uab.edu/)分析DNAJC9在LUAD中的表达及其与临床基本特征的关系。同时本研究利用UALCAN数据库中的Methylation甲基化分析了DNAJC9在肿瘤样本、肿瘤分期、淋巴结转移等各个亚组中的甲基化水平。利用TCGA Wanderer数据库(http://maplab.imppc.org/wanderer/index.html)分析DNAJC9与LUAD发生、发展相关的甲基化位点。

1.6 DNAJC9相互作用蛋白及通路富集分析

String数据库(https://string-db.org/)是由已知蛋白和预测蛋白分子之间相互作用的数据组成,包括直接和间接相互作用数据。本研究通过使用String数据库分析DNAJC9蛋白-蛋白相互作用网络(PPI),在数据库中输入"DNAJC9", 物种类型选择"Homosapiens", 置信度选择"Medium 0.400", 相互作用最大数选择10。利用FUNRICH软件对DNAJC9相互作用蛋白进行功能富集分析。

1.7 统计学分析

采用R软件(version.3.6.3; http://www.Rproject.org)对所有统计数据进行分析。采用Wilcoxon秩和检验和Logistic回归分析探讨DNAJC9与临床病理学参数的关系。采用DNAJC9表达评分进行单变量和多变量回归分析。采用Kaplan-Meier法构建生存曲线,差异采用Log-rank检验,并且使用单因素Cox比例风险回归分析估计操作系统的个体风险比(HR)。将单因素分析中P<0.05的因素纳入多因素Cox分析。测量HR和95%置信区间(CI)以估计单个因素的HR。采用Spearman相关性分析探讨基因之间的关系。所有结果的P值均为双侧,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生物信息数据库分析LUAD中DNAJC9的表达

TIMER数据库分析结果显示, DNAJC9在膀胱癌、乳腺癌、胆管癌、结直肠癌、食管癌、肝癌、肺鳞癌、LUAD、胃癌、甲状腺癌等大部分实体肿瘤中均呈高表达; TCGA数据库分析结果显示,非配对及配对组织中, DNAJC9在LUAD组织中的表达高于癌旁正常肺组织,差异有统计学意义(P<0.01), 见图1。

A: TIMER数据库中DNAJC9在泛癌中的表达; B: TCGA数据库中DNAJC9在LUAD与非配对组织中的表达;C: TCGA数据库中DNAJC9在LUAD与配对正常组织中的表达; D: TCGA结合GTEx数据库正常组织和LUAD组织中DNAJC9的表达。两者比较, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。

2.2 LUAD组织中DNAJC9的表达情况

DNAJC9在细胞质或细胞核中均有表达, DNAJC9蛋白在癌组织的表达率为80.0%(32/40), 高于癌旁组织的45.0%(18/40), 差异有统计学意义(P<0.05), 见图2。

A: DNAJC9蛋白在LUAD组织中的表达; B: DNAJC9蛋白在对应癌旁组织中的表达。

2.3 DNAJC9在LUAD中的预后分析

DNAJC9在LUAD的预后分析结果显示,高表达患者总生存率、无疾病生存率和无进展生存率表达降低,差异有统计学意义(P<0.05), 提示DNAJC9高表达患者预后更差。受试者工作特征(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)为0.889, 见图3, 表明DNAJC9在LUAD中的诊断价值较高。

A: 总生存期; B: 疾病特异性生存期; C: 无疾病进展生存期; D: ROC曲线。

2.4 DNAJC9表达与LUAD临床病理特征的关系

LUAD组织中, DNAJC9的表达高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.01); 与TP53未突变LUAD组织相比, TP53突变LUAD组织DNAJC9的表达升高,差异有统计学意义(P<0.01); 基于患者性别、种族、分期以及有无淋巴结转移等的亚组分析中,与正常组织相比, LUAD组织中DNAJC9的表达增高,见图4。

2.5 DNAJC9启动子甲基化水平与LUAD患者临床特征的关系

UALCAN数据库分析发现,LUAD组织较正常组织DNAJC9启动子甲基化水平较低; 在肿瘤分期中, 1、2、3、4期组织较正常组织的DNAJC9启动子甲基化水平降低; 淋巴结转移患者较正常组织DNAJC9启动子甲基化水平降低,见图5A～5C。TCGA Wanderer分析结果发现, DNAJC9与LUAD发生发展相关的甲基化位点有9个,分别是cg04197548、cg07061913、cg07959124、cg05313302、cg19838697、cg109519462、cg20441175、cg07982481、cg04745336, 均维持低甲基化修饰水平,见图5D。

A: DANJC9的甲基化状态在正常组织和LUAD的分布情况; B: DANJC9的甲基化状态在LUAD不同分期的分布情况; C: DANJC9的甲基化状态在LUAD不同淋巴结转移分期的分布情况; D: TCGA Wanderer数据库分析DNAJC9在LUAD中有意义的低甲基化位点。

2.6 DNAJC9表达与肿瘤免疫细胞浸润的关系

DNAJC9表达与B细胞(r=0.157,P<0.01)和中性粒细胞 (r=0.102,P<0.05)的浸润水平呈正相关。DNAJC9的高表达与T细胞、DC细胞、NK CD56dim细胞、巨噬细胞、Mast细胞、CD8 T细胞、B细胞、T辅助细胞、调节性T细胞、Th17细胞和Th2细胞具有显著相关性(P<0.05), 见图6。

A: DNAJC9表达水平与肿瘤免疫细胞浸润的相关性; B: DNAJC9高表达、低表达细胞中24种免疫细胞亚型富集分析。两者比较, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。

2.7 DNAJC9在LUAD中的表达与免疫检查点的关系

通过GEPIA数据库分析DNAJC9表达与LUAD中常见免疫检查点基因表达水平的相关性。DNAJC9基因与CTLA4、PDCD1、CD274、LAG3这4个免疫检查点基因的表达呈正相关,差异有统计学意义(r=0.11,P<0.05;r=0.11,P<0.05;r=0.27,P<0.01;r=0.12,P<0.05),见图7。

A: GEPIA数据库中DNAJC9与CTLA4表达的关系; B: GEPIA数据库中DNAJC9与PDCD1表达的关系;C: GEPIA数据库中DNAJC9与CD274表达的关系; D: GEPIA数据库中DNAJC9与LAG3表达的关系。

2.8 DNAJC9蛋白相互作用网络及功能富集分析

String数据库中分析得到具有11个节点的DNAJC9蛋白互作网络,包括微小染色体维持复合物成分6(MCM6)、核糖核苷酸还原酶催化亚基M1(RRM1)、核自身抗原精子蛋白(NASP)、皮瓣结构特异性内切酶(FEN1)、脱氧尿苷三磷酸酶(DUT)、复制因子C亚基4(RFC4)、序列相似的家族149成员B1 (FAM149B1)、MutS同源2(MSH2)、染色体的结构维持2(SMC2)、小染色体维持复合体成分2(MCM2)(score>0.900)。利用TCGA中的表达数据和DNAJC9的表达进行相关性分析,差异均有统计学意义(P<0.01), 结果见图8。富集分析显示,以上基因可能参与DNA复制、细胞周期等生物过程,均参与细胞增殖、细胞凋亡和免疫细胞浸润等生理功能。

A: DNAJC9蛋白互作网络; B: TCGA中与DNAJC9相关基因热图; C: FUNRICH软件通路富集分析。

3 讨 论

LUAD早期发现与诊断、治疗可以显著改善患者生活质量,因此临床迫切需要发现有效的诊断标志物和治疗方法。HSPs在多数肿瘤细胞中表达增高,并在肿瘤的生长、增殖、侵袭、转移和免疫浸润等生物学过程中起重要作用,与患者预后密切相关[6]。DNAJC9作为其中一员,可能也参与了肿瘤的进展。HAMMOND C M等[7]等发现, DNAJC9通过其J结构域招募HSP70型酶折叠组蛋白H3-H4底物,在复制和转录偶联的核小体组装过程中发挥作用从而介导细胞增殖。ZHANG Z等[8]研究发现,敲除DNAJC9显著降低了癌细胞系的细胞增殖和转移,表明该基因与肿瘤的进展有关。LYNG H等[9]发现,在转移性宫颈癌中,DNAJC9表达上调,且与预后明显相关,然而该基因在LUAD中的作用机制仍不明确。

本研究通过TIMER数据库分析发现,DNAJC9在多种肿瘤中均高表达,说明该基因在肿瘤中的表达具有普遍性。进一步分析TCGA中LUAD测序数据发现, DNAJC9在LUAD配对及非配对组织的表达均高于正常组织,且利用免疫组化方法检测结果发现, DNAJC9蛋白在LUAD组织中的表达高于癌旁组织。预后价值是评价分子标志物临床价值的重要指标。通过K-M法生存分析发现, LUAD中DNAJC9高表达患者总生存率、无疾病生存率和无进展生存率较低表达组降低。因此, DNAJC9有可能作为LUAD临床诊断及预后评估的一个重要指标。

为了探讨该基因影响LUAD进展及预后的作用机制,本研究评估了DNAJC9的表达与临床病理特征的关系。在基于患者性别、种族、分期以及有无淋巴结转移等亚组分析中,与正常组织组相比, DNAJC9在LUAD患者组织中的表达增高。本研究还发现, DNAJC9在LUAD突变组和无TP53突变组的表达差异有统计学意义,表明该分子在LUAD中的表达水平与肿瘤是否存在TP53突变可能有关。TP53为一种典型的抑癌基因,在细胞生长分裂和细胞损伤修复方面起着主要作用。TP53基因发生突变时,无法抑制细胞分裂和复制,导致癌症发生[10]。本研究发现,在TP53突变的肿瘤组织中DNAJC9显著高表达,说明该基因有可能是通过调节TP53突变而导致肿瘤进展,从而影响患者预后。

本研究还探讨了DNAJC9在LUAD中高表达的上游机制。DNA甲基化是调控基因表达的重要机制,与肿瘤发生发展有重要关系。DNA甲基化对应于基因表达,一般来说,活性转录的基因在启动子和增强子处缺失DNA甲基化,但含有高水平的基因体DNA甲基化,与基因表达呈负相关。本研究通过UALCAN数据库分析DNAJC9在LUAD中的表达与甲基化的关系,显示DNAJC9在LUAD中的DNA甲基化与转录表达呈负相关。因此,通过启动子甲基化对新的肿瘤抑制基因的识别可以揭示LUAD发生中的肿瘤抑制途径,并探索诊断和治疗LUAD的新方法。

免疫治疗作为目前LUAD治疗一种重要方法,在临床治疗中发挥着越来越重要的作用。肿瘤免疫浸润在恶性肿瘤的进展过程中发挥着关键作用[11]。ROCHA P等[12]研究显示, CD73在早期LUAD的免疫病理生物学中具有潜在意义,其高表达可以作为机体免疫应答的一个靶标。既往研究[13]显示, TTC21A可以作为评估LUAD预后和免疫细胞浸润水平潜在的生物标志物。基于此,探讨DNAJC9的表达在LUAD免疫浸润及治疗中的作用尤为重要。本研究分析发现,DNAJC9基因的表达与B细胞、中性粒细胞的免疫浸润水平均有显著相关性,表明DNAJC9有可能调控LUAD细胞的免疫浸润水平。此外,本研究的ssGSEA分析显示, DNAJC9的表达与T细胞、DC细胞、NK CD56dim细胞、巨噬细胞、Mast细胞、CD8 T细胞、B细胞、T辅助细胞、调节性T细胞、Th17细胞和Th2细胞具有显著相关性,提示LUAD患者DNAJC9高表达可能影响肿瘤免疫反应。为了进一步验证DNAJC9在LUAD免疫浸润中的作用,本研究利用GEPIA数据库分析了DNAJC9表达与B细胞、中性粒细胞的表面标志物的关系,并分析了DNAJC9与常规免疫检查抑制点基因的关系发现,CTLA4、PDCD1、CD274、LAG3的表达水平与该基因的表达呈正相关, CTLA4、PDCD1、CD274、LAG3靶点抑制剂已在临床免疫治疗中发挥了重要作用。因此, DNAJC9表达有可能为LUAD免疫浸润检测及治疗提供一定参考。

为了探讨DNAJC9的分子作用机制,本研究预测分析了与DNAJC9相互关联的蛋白,主要有MCM6、RRM1、NASP、FEN1、DUT、RFC4、FAM149B1、MSH2、SMC2、MCM2。其中, MCM6是一种重要的DNA复制调控因子,在维持细胞周期中起着至关重要的作用。ZENG T等[14]研究发现,持续增高的MCM6表达促进了肝细胞癌(HCC)的形成、发展和进展。另外,研究[15]显示, MCM6的高表达导致肾透明细胞癌患者肿瘤进展、转移。为了进一步探讨DNAJC9在LUAD发生、发展中的下游调控机制,本研究对与DNAJC9相关的蛋白进行了功能富集分析,而相关信号通路主要富集于DNA复制、DNA修复和细胞周期检查点信号通路,提示DNAJC9在LUAD中可能通过调控相关分子影响生物合成,改变细胞周期等相关通路,进而调控LUAD的发生、发展。

综上所述, DNAJC9在LUAD中呈高表达,且其高表达与患者的生存预后相关,该分子有可能参与LUAD细胞免疫浸润过程,表明DNAJC9可能作为LUAD的诊断和预后标志物以及免疫治疗靶点,但还需要进一步研究和实验。