黑曲霉改性葛渣膳食纤维的工艺优化及其理化功能特性

2023-07-09符慧珍邓梅张名位贾栩超董丽红黄菲马勤赵东张瑞芬

中国农业科学 2023年12期

符慧珍，邓梅，张名位，贾栩超，董丽红，黄菲，马勤，赵东，张瑞芬

符慧珍1,2，邓梅2，张名位2，贾栩超2，董丽红2，黄菲2，马勤2，赵东2，张瑞芬2

1海南大学食品科学与工程学院，海口 570228；2广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业农村部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室，广州 510610

【目的】筛选适宜粉葛渣膳食纤维（dietary fiber，DF）改性的微生物种类，优化建立其最佳改性条件，分析改性前后葛渣DF结构和理化功能特性差异，为粉葛加工副产物的综合利用提供理论依据和技术支撑。【方法】比较黑曲霉、米根霉、绿色木霉和枯草芽孢杆菌发酵对葛渣可溶性DF（soluble dietary fiber，SDF）得率的影响，确定最佳发酵菌种；以料液比、接种量、发酵时间、发酵温度和pH为条件进行单因素试验，以SDF得率为考察指标，通过Box-Benhnken中心组合试验设计优化葛渣DF的最佳改性工艺条件；通过酶解法从发酵改性前后的葛渣中提取不溶性DF（insoluble dietary fiber，IDF）和SDF，利用扫描电镜观察其微观结构，对比分析葛渣发酵改性对其IDF理化（持水力、持油力和溶胀力）和功能特性（葡萄糖、胆酸盐和胆固醇吸附能力）的影响。【结果】黑曲霉、米根霉和绿色木霉发酵葛渣均能不同程度地增加葛渣中SDF得率，其中黑曲霉效果最好，而枯草芽孢杆菌发酵对葛渣中SDF得率无显著影响。因此，本研究选定黑曲霉为葛渣DF微生物改性菌种。通过响应面优化确定黑曲霉最佳发酵条件为料液比1﹕5.8（m/v）、接种量4.9%（v/v）、发酵时间100 h、发酵温度24.9 ℃，在该条件下SDF得率由发酵前的6.34%增加到13.75%，IDF/SDF的比例由6.14下降至2.83。与发酵前相比，黑曲霉发酵后葛渣IDF和SDF呈现更为疏松多孔的微观结构。发酵后葛渣IDF的持水力和溶胀力均是发酵前的1.2倍，但持油力无显著变化。此外，发酵后葛渣IDF的葡萄糖吸附能力是发酵前的1.70倍，胆固醇吸附能力在pH 2.0和pH 7.0条件下分别是发酵前的1.44倍和1.28倍。【结论】4种受试菌株中，黑曲霉促进葛渣IDF转化为SDF的作用最显著，以SDF得率为指标优化建立了黑曲霉发酵改性葛渣DF的最佳工艺；发酵后葛渣SDF得率提高2.17倍，IDF的理化和功能特性均得到改善。

葛渣；黑曲霉；不溶性膳食纤维；可溶性膳食纤维；理化功能特性

0 引言

【研究意义】粉葛（）是一种药食同源的豆科葛属植物。制备葛根淀粉是目前粉葛最主要的加工方式。葛渣是粉葛制备淀粉过程中产生的副产物。据统计，我国每年葛渣产量近百万吨。葛渣是制备膳食纤维（dietary fiber，DF）食品配料或高纤食品的潜在资源[1]，但目前仅少部分作为肥料或饲料利用，大部分作为废弃物被丢弃，造成严重的资源浪费和环境污染。大量研究表明，DF具有调节肠道菌群、控制血糖和体重、降低癌症和心血管疾病发生风险等多种健康功效[2]。增加日常膳食中DF的摄入量是提升健康水平的重要措施。许多富含DF的农产品加工副产物，如果渣、谷物糠麸成为加工生产DF配料的重要原料。除了被直接加工成膳食营养素补充剂外，DF也在许多传统食品加工中得到应用，如面条、面包、饼干、火腿肠等，以提升产品的营养品质。根据DF在水中的溶解性可分为不溶性（IDF）和可溶性（SDF）膳食纤维，二者的理化和功能特性都具有明显的差异。有研究者认为DF中的IDF与SDF比值在3﹕1—2﹕1时，属于优质DF的范畴[3]。而且，SDF的可发酵特性使其在调节肠道微生态结构、改善肠道菌群失调等方面的作用明显优于IDF。葛渣DF主要为纤维素、半纤维素和木质素等IDF，SDF所占比例很低，过高含量的IDF导致其口感粗糙，感官品质差，限制了其在食品中的应用。因此，通过改性处理，提高葛渣中SDF比例，改善其理化和功能特性，对提高葛渣的综合利用价值、提升粉葛产业的经济效益具有重要意义。【前人研究进展】常见DF改性方法包括生物改性法，通过酶解或微生物发酵降解IDF；化学改性法，通过酸、碱和过氧化氢等化学试剂降解IDF，使其转化为SDF；物理改性法，通过挤压、超微粉碎、蒸汽爆破等过程中的高温、高压、剪切等作用破坏DF的糖苷键；也有研究将上述不同类型的方法联合使用，如超微粉碎—酶解、挤压—酶解[2,4]。龙伟等[5]比较不同改性方法对葛渣DF的影响，发现单独的超声和纤维素酶解对葛渣SDF含量无显著影响，超声辅助纤维素酶解则能够显著增加葛渣SDF得率（从9.63%增加至12.31%）。LIN等[6]比较不同改性方法对豆渣DF的影响，发现微波处理、微生物（保加利亚乳杆菌、粗糙脉孢菌）发酵均能显著增加SDF含量，其中微波处理效果最好。尽管前人已经开展了一些葛渣DF改性的研究，但多采用酶解[5]和化学改性[7]的方法，与其他DF改性方法相比，微生物发酵较酶法改性具有环保、条件温和的优点，同时还能克服酶价格昂贵导致的改性处理成本过高的缺陷。此外，微生物发酵过程中产生的代谢产物还能起到改善发酵产物风味品质的作用，具有较好应用前景。【本研究切入点】关于微生物发酵对葛渣DF的改性效果鲜见报道。另外，以往有关葛渣DF改性的相关研究多集中在改性处理提高SDF的得率方面，关于改性前后葛渣DF的理化和功能特性变化未进行系统研究，难以指导其在营养健康食品加工中的应用。【拟解决的关键问题】通过比较不同微生物发酵对葛渣DF的改性效果，筛选适宜的发酵菌种并优化建立其最佳的改性工艺，对比分析改性前后的葛渣中IDF（SDF）含量、微观结构、理化和功能特性等的差异，为粉葛加工副产物的综合利用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

试验于2022年在广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所农业农村部功能食品重点实验室进行。

1.1 主要材料与试剂

葛渣由张葛老葛根有限公司提供；黑曲霉（GIM 3.576）、米根霉（AS 3.866）、绿色木霉（GIM 3.597）和枯草芽孢杆菌枯草亚种（subsp GIM 1.372）均购自广东省微生物菌种保藏中心。液化酶（Termamyl 120 L，120 KNU-S/mL）、糖化酶（AMG 300 L，300 AGU/mL）、蛋白酶（Alcalase 2.4 L，2.4 AU/mL）购于诺维信（中国）有限责任公司；PDA培养基购自广州市齐云生物技术有限公司；LB培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

Eyelan-1100旋转蒸发器（东京理化器械株式会社），GL-20M高速冷冻离心机（湖南易达公司），LS—75HD高压灭菌锅（江阴滨江公司），干燥箱PH-030A（上海一恒科学仪器有限公司），恒温恒湿培养箱（上海跃进医疗器械有限公司），FW80粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司），扫描电镜（SU-3400N，Hitachi，Japan）。

1.3 方法

1.3.1 发酵菌种的制备菌株（黑曲霉、米根霉和绿色木霉）于30 ℃在PDA培养基上培养48—72 h至长满菌丝。用10 mL无菌水洗涤琼脂表面的菌丝，将洗涤下来的菌悬液移入装有无菌脱脂棉的离心管过滤，滤液用无菌水稀释成1×107—1×108CFU·mL-1的种子液备用[8]。枯草芽孢杆菌接种于10 mL LB培养基中，于培养箱中37 ℃震荡培养（180 r/min）24 h[9]，离心（4 000 r/min，10 min），弃上清液，再加入10 mL无菌水，混匀，得到种子液（1×107—1×108CFU·mL-1）备用。

1.3.2 葛渣发酵实验准确称取10 g葛渣，以1﹕5（m/v）的料液比加入蒸馏水后混匀，封口膜密封，经高压灭菌（121 ℃，15 min）后接入活化后的黑曲霉、米根霉、绿色木霉或枯草芽孢杆菌，接种量5%（v/v），30 ℃恒温培养箱中分别发酵0、24、48、72、96、120和144 h。

1.3.3 单因素试验称取10 g葛渣，固定的单因素条件为：料液比1﹕5，接种量5%，发酵时间96 h，发酵温度30℃，pH 6。设计单因素试验见表1。考察料液比、接种量、发酵时间、pH和发酵温度5个因素对葛渣发酵产物中SDF得率的影响。各单因素试验中，除了考察因素参照表1中的水平设置不同的处理外，其余各因素均采用上述固定的单因素条件。

1.3.4 Box-Behnken响应面试验设计在单因素试验的基础上，以料液比、接种量、发酵时间和发酵温度为响应面因素，SDF得率为响应值，运用Box- Behnken试验设计原理，进行4因素3水平响应面优化试验设计，因素水平表见表2。

1.3.5 葛渣IDF和SDF的提取采用ZHAO等[10]的方法分别提取葛渣中的IDF和SDF。分别取10 g发酵前后的葛渣，加入100 mL蒸馏水混匀，95 ℃水浴糊化10 min，依次加入下述各种酶液进行酶解处理：10 μL液化酶（pH 6.0，95 ℃水浴90 min），20 μL蛋白酶（pH 7.5，60 ℃水浴60 min）和10 μL糖化酶（pH 4.5，60 ℃水浴 60 min），反应结束后沸水中加热20 min使酶失活，离心（4 000 r/min，10 min）分离上清液和残渣，残渣经60 ℃蒸馏水洗涤2次后，50 ℃干燥24 h，得IDF。合并上清液和残渣洗涤液，60 ℃下旋蒸浓缩至原体积的1/4，加入4倍浓缩液体积的95%乙醇混匀，室温静置过夜，离心（4 000 r/min，10 min），所得沉淀物50 ℃干燥72 h，得SDF。样品中IDF（X）和SDF（Y）得率的计算公式如下：X（%）=M2/M1×100，Y（%）=M3/M1×100。其中，M2为IDF质量（g），M3为SDF质量（g），M1为葛渣质量（g）。将IDF和SDF粉碎，过60目筛，装入铝箔袋中于4 ℃冰箱保存用于后续分析。

表1 单因素试验设计水平表

表2 Box-Behnken响应面因素水平表

1.3.6 葛渣IDF和SDF的纯度测定参照国标的方法测定发酵前后葛渣IDF和SDF中水分（GB 5009.3—2016）、灰分（GB 5009.4—2016）、蛋白质（GB 5009.5—2016）、脂肪（GB 5009.6—2016）和淀粉（GB 5009.9—2016）的含量。IDF或SDF的纯度（%）=（M2-M1）×100，其中M1为IDF或SDF中水分、灰分、蛋白质、脂肪和淀粉的总量，M2为IDF或SDF的质量。

1.3.7 葛渣IDF和SDF的微观结构分析采用Hitachi扫描电子显微镜观察葛渣IDF和SDF的微观结构。葛渣IDF和SDF粉末用胶带固定，采用真空溅射镀膜机镀金，置于扫描电子显微镜下观察并拍照，图片扫描倍数分别为500×和2 000×。

1.3.8 葛渣IDF的理化特性分析持水力（WHC）测定：采用ZHENG等[11]的方法测定发酵前后葛渣IDF的持水力。将0.5 g葛渣IDF样品与50 mL蒸馏水充分混匀，室温静置18 h，10 000 r/min离心20 min。弃去上清液，称量吸水后样品的质量。

WHC（g·g-1）=（M1-M0）/M0

式中，M1：样品吸水后的质量（g）；M0：样品吸水前的质量（g）。

持油力（OHC）测定：采用ZHENG等[11]的方法测定发酵前后葛渣IDF的持油力。将0.5 g葛渣IDF样品与30 mL大豆油充分混匀，室温静置18 h，10 000 r/min离心20 min，弃上清液，称量残渣质量。

OHC（g·g-1）=（M1-M0）/M0

式中，M1：样品吸油后的质量（g）；M0：样品吸油前的质量（g）。

溶胀力（WSC）测定：采用ZHENG等[11]的方法测定发酵前后葛渣IDF的溶胀力。称取0.5 g葛渣IDF样品于刻度离心管中，加20 mL蒸馏水，充分混匀，室温静置18 h，测量溶胀前后样品的体积。

WSC（mL·g-1）=（V1-V0）/M

式中，V0：吸水溶胀前样品体积（mL）；V1：吸水溶胀后样品体积（mL）；M：吸水溶胀前样品质量（g）。

1.3.9 葛渣IDF的功能特性分析葡萄糖吸附能力（GAC）的测定：参照DENG等[12]的方法测定发酵前后葛渣IDF的葡萄糖吸附能力。准确称取0.5 g葛渣IDF样品，加入50 mL 100 mmol·L-1葡萄糖标准液，混匀，恒温水浴振荡（37 ℃，150 r/min）6 h后，10 000 r/min离心20 min，收集上清液，测定上清液中葡萄糖浓度。取1 mL上清液至20 mL洁净试管中，向其中加入0.75 mL 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂（DNS试剂配制参照文献[11]的方法），沸水浴5 min后迅速冰水浴至室温，再加入10.75 mL蒸馏水，振荡混匀，于540 nm测定其吸光度值。样品中葡萄糖浓度根据葡萄糖标准溶液绘制的标准曲线确定。GAC以每克IDF样品吸收葡萄糖毫克数表示。

GAC（mmol·g-1）=（C1-C2）×V/M

式中，C1：初始浓度中葡萄糖的浓度（mmol·L-1）；C2：经样品吸附后上清液中葡萄糖的浓度（mmol·L-1）；V：上清液体积（mL）；M：样品重量（g）。

胆固醇吸附能力（CAC）的测定：参照DENG等[12]的方法测定发酵前后葛渣IDF的胆固醇吸附能力。新鲜的鸡蛋黄用蒸馏水（v/v，1﹕9）稀释，搅拌均匀得蛋黄溶液。准确称取1.0 g葛渣IDF样品置于50 mL离心管中，加入25 mL蛋黄溶液，振荡混匀，分别用6 mol·L-1的HCl溶液和2 mol·L-1NaOH溶液将pH调至2.0和7.0，恒温水浴振荡（37 ℃，150 r/min）2 h后，10 000 r/min离心20 min，得上清液，取0.5 mL用冰乙酸稀释5倍后的上清液，加入0.2 mL 0.5 mg·mL-1的邻苯二甲醛和4 mL硫酸和冰乙酸混合物（v/v，1﹕1），室温静置10 min，于550 nm处测定其吸光值。样品中胆固醇浓度根据胆固醇标准溶液绘制的标准曲线确定。CAC以每克IDF样品吸收胆固醇毫克数表示。

CAC（mg·g-1）=[（Cb-Cd）-（Cy- Cb）]×V/M

式中，Cy：蛋黄溶液的胆固醇浓度（mg·mL-1）；Cd：样品吸附试验后蛋黄溶液的胆固醇浓度（mg·mL-1）；Cb：不含样品的蛋黄溶液的胆固醇浓度；V：蛋黄溶液的体积（mL）；M：样品重量（g）。

胆酸盐吸附能力（SCAC）测定：参照ZHENG等[11]的方法测定发酵前后葛渣IDF的胆酸盐吸附能力。向100 mL锥形瓶中加入1.0 g葛渣IDF样品和50 mL 2 mg·mL-1胆酸钠溶液，混匀，37 ℃水浴振荡2 h后，10 000 r/min离心20 min，得上清液，利用糠醛比色法测定胆酸钠浓度，取1 mL上清液加入6 mL 45%的硫酸水溶液和1 mL 0.3%的糠醛溶液，充分混匀，置于65 ℃恒温水浴锅中反应30 min，冷却至室温，于620 nm处测定其吸光度值。样品中胆酸钠浓度根据胆酸钠标准溶液绘制的标准曲线确定。SCAC以每克IDF样品吸收胆酸钠毫克数表示。

SCAC（mg·g-1）=（C1-C2）×V/M

式中，C1：胆酸钠溶液初始浓度（mg·mL-1）；C2：经样品吸附上清液中胆酸钠的浓度（mg·mL-1）；V：上清液体积（mL）；M：样品质量（g）。

1.4 数据统计与分析

每个样品每个指标重复测定3次，结果以均值（Means）±标准差（SD）表示，不同处理或不同样品间差异比较采用SPSS 23进行单因素方差分析或检验，＜0.05时表示差异达到显著性水平。

2 结果

2.1 不同微生物发酵下葛渣SDF得率的变化

4种微生物发酵不同时间后，葛渣中SDF得率变化如图1所示。黑曲霉、米根霉和绿色木霉发酵均能增加葛渣中SDF的得率，而枯草芽孢杆菌发酵对葛渣中SDF得率影响不显著。黑曲霉和米根霉发酵24 h后，葛渣中SDF的得率开始增加；绿色木霉发酵至48 h后，葛渣中SDF的得率开始增加。3种真菌均在发酵96 h时葛渣中SDF得率均达到最大水平（＜0.05），由发酵前的6.30%、6.92%和6.27%分别增加至13.54%（黑曲霉）、12.39%（米根霉）和8.92%（绿色木霉），其中黑曲霉发酵96 h的葛渣SDF得率高于其他2种真菌（＜0.05）。96 h后，3种真菌发酵的葛渣中，SDF得率开始持续下降，但在发酵终点（144 h），绿色木霉发酵的葛渣SDF得率与发酵前相当（6.25%），黑曲霉和米根霉发酵葛渣SDF的得率相当（9.05%和10.05%），但仍显著高于发酵前（＜0.05）。由此可知，黑曲霉发酵对葛渣DF的改性效果优于其他3种微生物，因此，后续采用黑曲霉进行发酵处理。

不同小写字母代表同一菌株不同发酵时间点具有显著性差异（P＜0.05）。下同

2.2 葛渣黑曲霉发酵单因素试验结果

葛渣SDF得率随料液比、黑曲霉接种量、发酵时间和发酵温度的变化，均呈现先增加后降低的趋势，其最高点分别为料液比1﹕6（g∙mL-1）、黑曲霉接种量5%、发酵时间96 h、发酵温度25 ℃，发酵过程中pH对葛渣SDF得率无显著性影响（图2）。

2.3 葛渣黑曲霉发酵条件的响应面优化试验结果

采用Box-Behnken进行响应面优化设计，结果见表3。利用Design-Expert 8.0.6软件对表2所得的试验数据进行回归分析，得到多元二次回归方程：= 13.181-0.48-0.15+0.48+0.092-0.23+0.93-0.045+1.000-0.02+0.19-0.96-1.392-1.622- 1.132-1.782，其中Y为SDF得率，A为料液比，B为接种量，C为发酵温度，D为发酵时间。由表4回归模型方差分析可知，该回归模型具有极显著性（＜0.0001）；失拟项不显著（＞0.05），2=0.9122，表明回归模型拟合程度较好，试验误差小，此模型可用来预测黑曲霉发酵改性葛渣SDF的最优工艺条件。该模型还反映出因素AC、CD、A2、B2、C2和D2对Y影响极显著，A和C对Y影响显著，B、D、AB、AD、BC和BD对Y影响不显著，可见因素A和C、C和D之间存在交互作用。从各因素对回归模型贡献的统计学显著性分析结果（值）可以看出，各因素对葛渣SDF得率的影响程度从大到小依次为：料液比＞发酵时间＞接种量＞发酵温度。图3显示，响应曲面越陡，因素对试验结果影响越大。料液比A和发酵温度C、发酵温度C和发酵时间D的响应面等高线呈椭圆形，进一步证明A和C、C和D之间有显著的交互作用[13]。

图2 不同因素对黑曲霉发酵葛渣SDF得率的影响

表3 响应面优化设计与结果

表4 回归模型的方差分析

*:＜0.05; **:＜0.01. 下同The same as below

结合多元回归方程，利用Design-Expert 8.0.6软件分析，得最大理论预测值为13.26%，最优发酵条件为料液比1﹕5.78、接种量4.82%、发酵时间100.24 h、发酵温度24.89 ℃。为方便操作，将试验条件修正为料液比1﹕5.8、接种量4.9%、发酵时间100 h、发酵温度24.9 ℃。在此条件下重复3次以验证，得到实际SDF得率为（13.75±0.58）%，比理论预测值仅高0.49%，说明建立的回归模型有较好的拟合性，该模型可用于实际生产中进行预测。

2.4 黑曲霉发酵前后葛渣膳食纤维的含量变化

发酵前后葛渣IDF和SDF纯度相当，且均处于较高水平（＞0.05）。黑曲霉发酵前后葛渣的IDF得率无显著变化，但发酵后葛渣的SDF和TDF得率分别较发酵前提高2.17倍（＜0.01）和1.16倍（＜0.05），且发酵后葛渣中IDF/SDF比例由6.14下降至2.83（＜0.05）（表5）。由此可知，黑曲霉发酵可显著提高葛渣SDF的比例，使葛渣DF的IDF/SDF比值较为均衡。

2.5 黑曲霉发酵前后葛渣膳食纤维微观结构的变化

黑曲霉发酵前后葛渣IDF和SDF的微观结构如图4所示。发酵前后葛渣IDF和SDF形态结构区别明显。未发酵葛渣IDF结构致密，表面较为光滑平整；发酵后葛渣IDF表层结构破坏严重，出现较多褶皱和孔洞，表面较为粗糙。未发酵葛渣SDF的微观结构表面呈现致密的网状结构，发酵后葛渣SDF结构更显蓬松。由此可知，黑曲霉发酵可破坏葛渣IDF和SDF微观结构，增加其表面积。

A：料液比和发酵温度；B：发酵温度和发酵时间 A: solid-liquid ratio and fermentation time; B: fermentation temperature and fermentation time

图4 黑曲霉发酵前后葛渣IDF（A、B）和SDF（C、D）的微观结构

表5 黑曲霉发酵前后葛渣中膳食纤维的组成及含量

TDF为IDF与SDF的和。括号内数据表示IDF或SDF的纯度

TDF: The sum of IDF and SDF. Values in parentheses indicate purity of the IDF or SDF

2.6 黑曲霉发酵前后葛渣膳食纤维理化特性的变化

黑曲霉发酵后的葛渣IDF的持水力（（11.49±0.16）g∙g-1DW）和溶胀力（（10.04±0.04）g∙g-1DW）显著高于未发酵葛渣IDF（＜0.05），均是未发酵葛渣IDF的1.2倍，但黑曲霉发酵对葛渣IDF的持油力影响不显著（＞0.05）（图5）。

2.7 黑曲霉发酵前后葛渣膳食纤维功能特性的变化

发酵前后葛渣IDF的葡萄糖、胆酸盐和胆固醇吸附特性如图6所示。黑曲霉发酵处理葛渣IDF的葡萄糖吸附能力和胆酸盐吸附能力均显著增加，其中发酵后葛渣IDF的葡萄糖吸附能力极显著高于发酵前（＜0.01），是后者的1.70倍。分别采用pH 2.0和pH 7.0的体系模拟胃和小肠环境，评价葛渣IDF的胆固醇吸附性能。黑曲霉发酵葛渣IDF在pH 2.0和pH 7.0时的胆固醇吸附能力均极显著高于未发酵葛渣IDF（＜0.01），分别是后者的1.44倍和1.28倍。此外，发酵前后葛渣IDF在pH 7.0时的胆固醇吸附能力高于pH 2.0，提示葛渣IDF在肠道中的胆固醇吸附能力比在胃中强。

*: P＜0.05; **: P＜0.01. 下同The same as below

图6 黑曲霉发酵前后葛渣IDF的功能特性

3 讨论

3.1 不同微生物发酵影响葛渣的SDF得率

微生物生长过程中可分泌多种酶催化降解DF类大分子物质。如黑曲霉具有产纤维素酶、半纤维素酶和聚半乳糖醛酸酶（果胶酶）等活性[14]，且黑曲霉被证明纤维素酶产量最高的菌株之一[15]。米根霉具有产糖化酶、果胶酶和纤维素酶活性[16]，胡畔等[17]研究表明米根霉发酵玉米粉可降解其纤维素，从而降低其纤维素含量。绿色木霉可分泌纤维素酶和木聚糖酶等[18]。余强等[19-20]研究表明绿色木霉能够降解纤维素和半纤维素成为可溶性物质，从而提高SDF的含量和改善其生理功能。枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、脂肪酶和淀粉酶等[21-22]。枯草芽孢杆菌枯草亚种能够分解纤维素和半纤维素，可降低木质纤维素和半纤维素含量，产生有益活性成分[23]。微生物分泌的这些酶可使DF组分之间的连接键断裂，从而使部分IDF转化成SDF。因此，本研究选取黑曲霉、米根霉、绿色木霉和枯草芽孢杆菌4种代表性的微生物发酵葛渣。黑曲霉、米根霉和绿色木霉发酵96 h时，葛渣SDF得率分别达到最大，之后逐渐降低，其原因可能是随着发酵时间延长，微生物不断繁殖，其产酶量也逐渐增加，降解葛渣中的IDF，使其部分转化成SDF，至发酵后期，随着微生物总量的不断增加，分泌的酶在降解IDF的同时开始分解利用SDF，将其降解为小分子糖等[24-25]，从而导致SDF得率降低。本研究中黑曲霉改性效果优于其他菌种，这可能与葛渣IDF主要由纤维素、半纤维素和木质素组成[26]，而黑曲霉主要分泌纤维素酶、半纤维素酶[14]有关。黑曲霉在很多不同来源的DF改性处理中，显示出优于其他微生物的效果。吴丽萍等[27]比较毛霉和黑曲霉发酵对毛竹笋SDF提取率的影响，发现经黑曲霉发酵后毛竹笋SDF提取效果最佳。李伟伟等[28]比较了米曲霉、黑曲霉和毛霉发酵对豆渣DF的影响，发现与未发酵豆渣相比，米曲霉、黑曲霉和毛霉发酵均能显著增加豆渣SDF含量，其中黑曲霉发酵后豆渣SDF含量最高。

3.2 葛渣黑曲霉发酵条件的响应面优化

不同微生物有其适宜的生长代谢条件，温度和水分含量均是影响黑曲霉生长繁殖的重要因素。本研究中，料液比为1﹕6、温度为25 ℃时葛渣SDF得率最大，后逐渐降低。表明上述条件是黑曲霉在葛渣中生长繁殖的适宜条件。当水分较少时，黑曲霉的繁殖速度受到影响，且样品与菌种接触不充分，影响微生物分泌的酶与IDF的作用，使SDF得率较低。当水分过多时，培养基通气性变差，影响菌体对氧的利用，不利于黑曲霉的生长[29-31]，从而影响改性效果；同样地，在适宜的温度下，黑曲霉的代谢最旺盛，温度过高时，黑曲霉容易过早老化，产酶速度也相应降低[24]。葛渣SDF得率随黑曲霉接种量先升高后降低的原因可能是因为接种量过大时，营养物质不能满足菌体生长的需要，菌体开始利用SDF所致[30,32]。当发酵时间为96 h时葛渣SDF得率最大，后随发酵时间延长而下降并趋于平缓。这可能是因为发酵前菌体生长迅速，分泌纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶等不断增加[33]，使IDF部分转化成SDF，从而提高SDF得率，但随着发酵时间延长，基质中的能源物质被消耗殆尽，微生物开始利用SDF[34]，使SDF得率降低。适宜黑曲霉生长的pH值范围较宽（pH 3—7），这可能是本研究在体系pH 4—6内葛渣SDF得率影响不显著的主要原因。

王宏勋等[26]采用药用真菌粉葛渣，在发酵温度37 ℃、接种量15%、种龄96 h、发酵时间8 d条件下，葛渣SDF含量达到13.6%，与本研究结果相当。黑曲霉发酵后葛渣中SDF得率高于乳酸菌发酵的小米麸皮（7.6%）[35]、纳豆芽孢杆菌发酵的小米麸皮（13.2%）[9]和黑曲霉A020发酵的香蕉皮（12.83%）[36]，但低于绿色木霉发酵的杏渣（15.69%）[37]、黑曲霉发酵的柚子皮（19.08%）[30]和绿色木霉发酵的脱脂米糠SDF（33.4%）[38]。当DF中IDF/SDF比值在3﹕1— 2﹕1时，具有更好的生理功能[3]。本研究中，黑曲霉发酵后葛渣IDF/SDF比值（2.9）在3﹕1—2﹕1内，由此可知，发酵后的葛渣可作为DF配料在食品加工中应用。

3.3 黑曲霉发酵影响葛渣IDF理化功能特性

微生物发酵除降解IDF使其转化为SDF外，在酶的分解作用下IDF自身的结构和功能特性也可能发生一些变化。王宏勋等[26]和吴德智等[39]分别利用药用真菌和混合菌（保加利亚乳杆菌﹕嗜热链球菌=1﹕1）发酵葛渣后，发现葛渣粉的持水力和溶胀力均增加。但对于微生物改性对葛渣IDF理化和功能特性的影响尚不清楚。因此，本研究对葛渣发酵前后的IDF理化和功能特性进行了分析。IDF持水力和溶胀力受IDF基本成分、孔隙率、粒度、比表面积和微观结构等因素的影响[12,40]。黑曲霉发酵后，葛渣IDF的持水力和溶胀力显著增加，可能是因为发酵使葛渣IDF微观结构更为疏松多孔，增大了其比表面积，暴露更多可与水结合的位点，有助于水分子的渗透和吸收。IDF持油力与其疏水性、总电荷密度和表面性质等因素有关[41]。葛渣发酵后，其IDF的持油力与发酵前差异不显著，这可能是由于发酵后其结构变化所致。SUN等[42]采用红曲霉发酵豆渣后，其DF的持水力和溶胀力显著增加，但其持油力无显著变化。田亚红等[43]采用黑曲霉发酵甘薯渣后，其IDF的持水力和溶胀力显著增加。上述研究均与本研究的结果一致。本研究中，葛渣IDF的持水力、持油力和溶胀力均高于柚皮IDF（分别为8.47 g·g-1、2.15 g·g-1和5.40 mL·g-1）[41]和麦麸IDF（分别为4.32 g·g-1、3.09 g·g-1和3.55 mL·g-1）[44]。

DF的功能特性因其来源而异，各种加工处理会导致DF组成和微观结构的改变，进而影响其功能特性。本研究采用葡萄糖、胆酸盐和胆固醇吸附能力评价葛渣IDF的功能特性。黑曲霉发酵显著提高葛渣IDF的葡萄糖、胆酸盐和胆固醇吸附能力，这可能与发酵后葛渣IDF较发酵前呈现更疏松多孔的微观结构有关。本研究中，发酵前后葛渣IDF的葡萄糖吸附能力分别为6.73和11.41 mmol∙g-1DW，高于燕麦（0.43 mmol·g-1）[45]、桃子（0.72 mmol·g-1）[45]、胡萝卜渣IDF（2.634 mmol·g-1）[46]。发酵前后葛渣IDF胆酸盐吸附能力分别为96.78和98.20 mg∙g-1DW，高于人参（21.86 mg·g-1）[47]和荷叶IDF（90.95 mg·g-1）[48]。胆固醇吸附能力是体外评价DF潜在降血脂功能的重要指标，葛渣IDF在pH 7.0时的胆固醇吸附能力高于pH 2.0，表明IDF对胆固醇的吸附主要发生在肠道而不是胃中，这与小米麸皮[9]和人参DF[47]的胆固醇吸附特性一致。葛渣IDF的胆固醇吸附能力高于小米麸皮DF（pH 2.0，9.2 mg·g-1；pH 7.0，14.3 mg·g-1）[9]，但低于人参IDF（pH 2.0，20.48 mg·g-1；pH 7.0，36.30 mg·g-1）[47]。

DF的理化和功能特性与其生理功能密切相关，DF的持水力和溶胀力可延迟胃排空，减少小肠通过时间，持油力可抑制肠腔中脂质吸收。DF对葡萄糖、胆酸盐和胆固醇等的吸附性能可以延缓膳食中葡萄糖和脂质的吸收速度，是DF发挥潜在调节糖、脂代谢等生理功能的基础[11]。黑曲霉发酵提高葛渣DF中SDF比例的同时，也显著改善其IDF的理化和功能特性，发酵葛渣IDF具有较强的葡萄糖、胆酸盐和胆固醇吸附能力。由此可知，发酵后葛渣是优质DF的来源，作为功能性成分在功能性食品中具有潜在的应用价值。

4 结论

本研究通过比较黑曲霉、米根霉、绿色木霉和枯草芽孢杆菌发酵对葛渣SDF得率的影响，筛选出促进SDF转化作用最显著的黑曲霉为发酵菌种；通过响应面优化试验建立了葛渣黑曲霉发酵改性DF的最佳工艺条件：料液比1﹕5.8，接种量4.9%，发酵时间100 h，发酵温度24.9 ℃，发酵后葛渣SDF的得率从6.34%提高至13.75%，葛渣IDF/SDF比值从6.14降为2.83。此外，与发酵前葛渣IDF相比，黑曲霉发酵后葛渣IDF的持水力、溶胀力及葡萄糖、胆酸盐和胆固醇吸附能力均显著增强。黑曲霉发酵后葛渣IDF/SDF比例均衡，且IDF的理化功能特性明显改善。因此，黑曲霉发酵是一种适宜葛渣DF改性的加工方式，改性后的葛渣是一种适用于加工功能性食品的食品配料。

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The Optimal Fermentation Technique ofResidues byfor Dietary Fiber Modification and the Consequent Changes of Physicochemical and Functional Properties of Dietary Fibers

FU HuiZhen1,2, DENG Mei2, ZHANG MingWei2, JIA XuChao2, DONG LiHong2, HUANG Fei2, MA Qin2, ZHAO Dong2, ZHANG RuiFen2

1College of Food Science and Engineering, Hainan University, Haikou 570228;2Sericultural & Agri-Food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture and Rural Affairs /Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Guangzhou 510610

【Objective】 The objectives of the present study were to screen the microbial species suitable for modification of dietary fiber (DF) ofresidues, to establish the optimum fermentation conditions, and to clarify the changes of microstructure, physicochemical and functional properties ofresidues DF before and after fermentation modification.【Method】,,andsubsp were used to fermentresidues, respectively, and the most effective microbial strain was screened by comparing the SDF yield ofresidues. The single factor experiments were carried out to screen the factors influencing DF modification. Then, the Box-Benhnken central composite experiment was designed to establish the optimum DF modification conditions ofresidues with the SDF yield as the index of evaluation. The insoluble DF (IDF) and SDF ofresidues before and after modification under optimal fermentation conditionswere extracted by enzymatichydrolysis method. The microstructures of IDF and SDF were observed by scanning electron microscope, and the physicochemical (water holding, oil holding, and water swelling capacity) and functional properties (adsorption capacity of glucose, sodium cholate and cholesterol) of IDF samples from unfermented and fermentedresidues were analyzed.【Result】The fermentation ofresidues, by,orall increased the SDF yield, andwas the most effective species. However, the fermentation withsubsp had no significant effects on the SDF yield. Therefore,was selected as the most suitable strain forresidues fermentation. The optimal fermentation condition determined by response surface optimization was as follows: The ratio of solid-liquid was 1:5.8 (m/v), the inoculation volume was 4.9% (v/v), the fermentation time was 100 h, and the fermentation temperature was 24.9 ℃. Under this condition, the yield of SDF increased from 6.34% to 13.75%, while the ratio of IDF/SDF decreased from 6.14 to 2.83. Both IDF and SDF extracted from fermentedresidues byshowed more porous microstructure than those from unfermentedresidues. Fermentation ofresidues increased the water holding and swelling capacity of its IDF by 20 percent approximately, while it showed no significant effects on the oil holding capacity. In addition, after fermentation, the adsorption capacity of IDF ofresidues for glucose increased by 70%, and the adsorption capacity for cholesterol increased by 44% and 28% at pH 2.0 and pH 7.0, respectively. 【Conclusion】could modify DF ofresidues more effectively than other 3 microbial strains. Under the fermentation condition, the SDF yield ofresidues increased by 2.17 times after modification by, and the physicochemical and functional properties of its IDF were also improved significantly.

residues;; insoluble dietary fiber; soluble dietary fiber; physicochemical and functional properties