北京市通州区即食非发酵豆制品微生物污染状况及致病菌分析

赵凤玲，李盼盼，高 翔，罗宇馨，王润萍，高 静

（1.北京市通州区疾病预防控制中心，北京 101100；2.河北北方学院，河北张家口 075000）

大豆及其制品的蛋白质含量居植物蛋白之首，有防癌、护肝、降血压、增强免疫力等保健作用[1]，其含有的大豆异黄酮和大豆皂苷在治疗动脉粥样硬化、冠心病、抗肿瘤等方面有积极的效果[2]，越来越受到消费者推崇。但豆制品中所含丰富营养物质又为微生物提供了理想的生长条件，如果保存不当受到微生物的污染很容易大量增殖，会给消费者的健康带来极大的威胁[3]。即食非发酵豆制品日常消费量很大，包括豆腐、豆浆、豆丝、豆干、凉拌菜等，因为其直接入口的特点，致病微生物的污染会对消费者的健康造成极大的伤害。本研究基于2020 年底对北京市通州区开展的一次即食非发酵豆制品的微生物污染状况监测，分析了北京市通州区不同包装、不同采样场所即食非发酵豆制品微生物污染情况，以期为当地食源性疾病的风险评估提供依据。

1 材料与方法

1.1 即食非发酵豆制品样品采集

利用无菌操作技术在北京市通州区大型超市、农贸市场、网店采集即食非发酵豆制品共70 份，采样量≥250 g/份，大型超市30 份，农贸市场30 份，网店10 份，其中散装45 份、预包装25 份，采样后立即低温运送至实验室检测。

1.2 材料与仪器

革兰阳性/阴性需氧菌药敏检测板（上海星佰）；沙门氏菌诊断血清（丹麦SSI）；单增李斯特菌血清分型抗体（日本DenkaSeiken）；致泻大肠埃希氏菌核酸检测试剂盒（北京良润）；单核细胞增生李斯特氏菌毒力基因和分型引物，由上海生工合成；AscI和Xba Ⅰ限制性核酸内切酶（TAKARA）。

电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；VITEK2 COMPACT30 全自动细菌生化分析系统（法国生物梅里埃公司）；普通PCR 仪（美国BIO-RAD 公司）；罗氏实时荧光定量PCR 仪（Roche Diagnostics Ltd）；全自动DNA/RNA 分析系统（QIAGEN）；脉冲场凝胶电泳仪及凝胶成像分析系统（美国BIO-RAD 公司）。

1.3 同时期参比致病菌株

2020 年6 月—12 月北京市通州区食源性疾病腹泻病例中分离的沙门氏菌；2018—2020 年北京市通州区单核细胞增生李斯特氏菌病例监测中分离的菌株；2020 年6 月—12 月北京市通州区食源性疾病腹泻病例中分离的致泻大肠埃希氏菌。

1.4 检测项目和方法

检验项目为菌落总数、大肠菌群计数、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和致泻大肠埃希氏菌，均按GB 4789 系列标准[4-9]进行检测。致病菌鉴定均用全自动细菌生化分析系统VITEK2 COMPACT30。

1.5 致病菌分离株的分析方法

利用血清凝集方法测定血清型；用微量肉汤稀释法进行药敏分析；用PCR 方法分析毒力基因；参考国家致病菌识别网技术规范将豆制品中分离的菌株与同时期通州区食源性疾病腹泻病例中分离的同类菌株进行PFGE 分子分型。

1.6 结果判定

1.6.1 评价标准

参照《 食品安全国家标准 面筋制品》（GB 2711—2014）[10]、《食品安全国家标准豆制品》（GB 2712—2014）[11]、《食品安全国家标准 食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[12]以及《食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[13]评价豆制品微生物污染情况；数据统计应用SPSS 24.0 软件，计数资料均用率表示，卡方检验，当P＜0.05 时，表示差异具有统计学意义。

1.6.2 药物敏感性

根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的相应标准评价致病菌的药敏结果，获得相应敏感（S）、中度敏感（I）和耐药（R）的结果。

1.6.3 PFGE 图谱

用Bionumerics 7.6 软件分析菌株间的亲缘性，采用非加权配对平均法，位置容许度为1.5%。

2 结果与分析

2.1 即食非发酵豆制品的微生物检测情况

样品共计70 份，总合格率38.57%（27/70），菌落总数合格率38.57%（27/70），大肠菌群合格率85.71%（60/70）。致病菌检出率20.00%（14/70），其中5 株沙门氏菌（7.14%），4 株单核细胞增生李斯特菌（5.71%），5 株致泻大肠埃希氏菌（7.14%）。

2.2 不同包装即食非发酵豆制品的检测情况

预包装菌落总数合格率显著高于散装样品（χ2=18.341，P＜0.05）；预包装大肠菌群合格率稍高于散装样品（χ2=2.180，P＞0.05）；预包装致病菌检出率显著低于散装样品（χ2=6.222，P＜0.05），具体数据见表1。

表1 不同包装即食非发酵豆制品的微生物指标检测结果

2.3 不同采样场所即食非发酵豆制品的检测情况

3 类采样场所样品的合格率分别为农贸市场20.00%、超市56.67%、网店40.00%，差异有统计学意义（χ2=8.520，P＜0.05），见表2。

表2 不同采样场所即食非发酵豆制品的检测情况

2.4 致病菌分离结果

2.4.1 沙门氏菌

（1）血清分型。5 株沙门氏菌中2 株为鼠伤寒沙门氏菌，1 株为肠炎沙门氏菌，1 株为阿姆斯特丹沙门氏菌，1 株为德尔卑沙门氏菌。

（2）耐药情况。受试的15 种抗生素中，所有菌株对亚胺培南、头孢西丁、庆大霉素、阿奇霉素和环丙沙星的敏感率为100%，对氨苄西林、氨苄舒等呈现不同程度的耐药性，见表3。

表3 沙门氏菌菌株耐药情况

（3）PFGE 分型。将豆制品中分离沙门菌株及同时期腹泻病例分离沙门菌株进行PFGE 分析，菌株间条带相似度介于57.3%～100.0%，来源于市场的3号豆制品的菌株与来源于病例的2、3、4、5 号菌株带型相似度为88.7%，来源于市场的1 号豆制品的菌株与来源于病例的1 号菌株带型相似度达77.4%，见图1。

图1 沙门氏菌PFGE 图

2.4.2 单核细胞增生李斯特菌

（1）毒力基因及血清分型。分离出的4 株单核细胞增生李斯特氏菌，3 株血清型为1/2a，1 株血清型为1/2b，所有菌株6 对毒力基因（prfA、plcA、iap、hly、plcB、inlA）均为阳性。

（2）耐药情况。单核细胞增生李斯特氏菌在受试的15种抗生素中，对多数抗生素敏感，但对苯唑西林、环丙沙星、头孢西丁100%耐药，见表4。

表4 单核细胞增生李斯特氏菌菌株耐药情况

（3）PFGE 分型。将豆制品分离株及近3 年病例检测出的菌株进行PFGE 分析，菌株间条带相似度介于56.9%～90.9%。来源于豆制品的3 号带型与来源于病例的6 号带型只相差2 个条带，相似度达90.9%，与7 号带型相差3 个条带，相似度达86.4%；来源于豆制品的2 号带型与来源于病例的5号带型相差4 个条带，相似度达80.0%，见图2。

图2 单核细胞增生李斯特氏菌PFGE 图

2.4.3 致泻大肠埃希氏菌

（1）毒力基因及血清分型。5 株致泻大肠埃希氏菌均携带astA 毒力基因，为肠聚集性大肠埃希菌（Enteroaggregative Escherichia coli，EAEC）。

（2）耐药情况。受试的15 种抗生素中，5 株致泻大肠埃希氏菌对头孢他啶、氨苄舒、亚胺培南、头孢西丁、头孢噻肟、庆大霉素、阿奇霉素的敏感率为100%，对头孢唑林和环丙沙星的敏感率为80%，对四环素和复方磺胺呈现不同程度的耐药，见表5。

表5 致泻大肠埃希氏菌菌株耐药情况

（3）PFGE 分型。将豆制品5 株致泻大肠埃希氏菌分离菌株及同时期腹泻病例致泻大肠埃希氏菌分离菌株进行PFGE 分析，菌株间条带相似度介于62.5%～77.3%，来源于豆制品的菌株与同期病例菌株未见较近的亲缘关系，见图3。

图3 致泻大肠埃希氏菌PFGE 图

3 讨论

3.1 总体情况

此次检测非发酵性即食豆制品共计70 份，合格率仅为38.57%，表明北京市通州区非发酵性即食豆制品卫生质量不容乐观。这与吕秋艳等[14]在北京市门头沟区非发酵豆制品微生物污染调查分析中的合格率25%相比较高，与刘晓娟[15]在邯郸市非发酵豆制品微生物污染调查分析中的合格率39.16%结果相近。菌落总数合格率仅38.57%，说明产品在加工、运输、储存和售卖等环节均可能有微生物污染。并且检出14 株致病菌，表明非发酵即食豆制品有引起食物中毒的潜在危险。

3.2 散装和预包装

预包装豆制品合格率为72.00%，远远高于散装豆制品的20.00%，与雷少华[16]的研究结果相一致。卫生指标菌（菌落总数和大肠菌群）散装样品合格率仅为20.00%，而预包装产品合格率72.00%，提示散装产品在加工、运输、储存、售卖等各个环节中更容易受到微生物的污染。特别是检出的14 株致病菌，有13 株来自散装豆制品，致病菌检出率为28.89%，说明散装即食非发酵豆制品存在很大的食品安全隐患。为了保障食品安全，应该进一步研究探讨微生物污染的来源，采取相应的控制措施，提高产品的卫生合格率。也提示产品包装是防止微生物污染的有效手段，为相关部门对豆制品的安全管理提供依据。

3.3 销售场所

不同销售场所菌落总数合格率分别为超市56.67%、网店40.00%、农贸市场20.00%。超市的合格率最高，这可能是因为超市对于产品质量把控严格，进货渠道正规，储存条件适宜；合格率最低的是农贸市场，这可能与农贸市场卫生状况较差，没有良好的防尘、防蝇措施以及冷藏条件有关；网店是新兴事物，还缺乏相关的管理规范，卫生条件良莠不齐，总体合格率也不高。此外农贸市场样品致病菌检出率最高，刘琴等[17]的研究表明沙门氏菌等致病菌的污染在一定程度上是由农贸市场较差的卫生条件所致，提示卫生管理部门应对农贸市场卫生条件较差的小摊位加强监督管理，坚决取缔不合格的经营摊点。此外应尽快出台对网店的监管措施，做好食品安全工作，保证消费者的身体健康。

3.4 致病菌情况

（1）沙门氏菌。在分离出的沙门氏菌中，有2 株鼠伤寒沙门氏菌，1 株肠炎沙门氏菌，调查显示鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌是导致人群感染沙门氏菌病的主要血清型[18]，这些沙门氏菌对氨苄西林、头孢唑林等呈现不同程度耐药性。在PFGE 聚类分析中，来源于市场的3 号豆制品PFGE 条带与来源于病例的2、3、4、5 号条带相似度为88.7%，表明为同一克隆群，因缺少病例流行病学资料未能成功溯源，但提示该豆制品可能为沙门氏菌感染性腹泻相关的风险食品。

（2）单核细胞增生李斯特氏菌。资料显示，在单核细胞增生李斯特氏菌中，常见的能够致病的血清型为1/2a、1/2b 和4b[19]。本研究中分离出的单核细胞增生李斯特氏菌中，3 株血清型为1/2a，1 株血清型为1/2b，是常见致病血清型。此外，单核细胞增生李斯特氏菌致病性与毒力基因密切相关，prfA 是调控基因，缺失后会使单增菌毒力丧失[20]，plcB 产生磷脂酰胆碱磷脂酶促进细菌在宿主间的扩散[21]，inlA 是内化素基因与细菌的侵袭力有关[22]，iap 产生p60 蛋白[23]，hiy 产生溶血素，plcA 基因编码一个特异作用于磷脂酰肌的磷脂酶，它主要协同plcB 发挥作用[24]，本次检测所有单核细胞增生李斯特氏菌6 对毒力基因均为阳性。在PFGE 聚类分析中，有病例菌株和农贸市场豆制品菌株条带相似度达90%以上，说明可能是同一克隆来源的菌株，且致病的单核细胞增生李斯特氏菌可能在本地区长期存在，散装即食豆制品是风险食品。

（3）致泻大肠埃希氏菌。在分离的大肠埃希氏菌中，所有菌株均携带astA 毒力基因为EAEC，与李梅基等[25]调查的优势菌株类型和毒力基因一致。在伊朗、巴西儿童腹泻病例致泻大肠埃希氏菌的研究中，EAEC 的检出率居首位[26]。豆制品分离出的EAEC 对复方磺胺和四环素耐药，这为今后临床治疗儿童腹泻病例提供了方向。

4 结论

北京市通州区即食非发酵豆制品污染较为严重，将检出的食源性致病菌和病例菌株进行比对分析，发现存在食品安全隐患；网店作为新兴购物渠道，国内外还未见有即食非发酵豆制品网店样本的相关报道，本研究做了初步的探索，发现与超市、农贸市场等常规采样场所对比，样品检验合格率处于居中水平，但整体合格率较低。本次即食非发酵豆制品的采样量比较小，分析还不够透彻，且没有分析季节变化对污染状况的影响，后续应继续完善相关研究数据。