一起云南不明原因猝死案件中4 种野生菌的细胞毒性

2023-07-06龙武瞿鹏飞马琳王蕊习严梅李玉华聂胜洁段婷杜进良唐雪赵静峰雷普平王跃兵

法医学杂志 2023年2期

龙武，瞿鹏飞，马琳，王蕊，习严梅，李玉华，聂胜洁，段婷，杜进良，唐雪，赵静峰，雷普平，王跃兵

1.昆明医科大学法医学院，云南昆明 650500；2.北京大学医学部基础医学院病理学系，北京 100191；3.云南省地方病防治所，云南大理 671000；4.云南大学化学科学与工程学院教育部自然资源药物化学重点实验室云南省天然产物转化与应用重点实验室，云南昆明 650500

云南不明原因猝死（Yunnan sudden unexplained death，YNSUD）是一类特殊的不明原因猝死（sudden unexplained death，SUD），主要发生于云南中、西部山区或半山区，时间集中于每年的6～9 月，即使通过尸体解剖、组织病理学检验及其他各种辅助检查，仍然不能明确死因[1-2]。流行病学研究[3]还发现，YNSUD 在同一家庭或同一家族中发生率较高，表现出家庭或家族聚集性的特点。YNSUD 的病因和死亡机制迄今尚未阐明，虽然多位学者先后提出过肠道病毒感染、低硒、饮用水污染、遗传疾病等假说[4]，但都还不能被广泛接受。此前有报道提出毒沟褶菌（Trogia venenata，又称“小白菌”）中毒学说[5]，得到较为广泛的认同，然而，之后的调查发现，部分YNSUD 病区并无毒沟褶菌分布[6-8]，针对毒沟褶菌的预防措施也未能完全阻止YNSUD 的再次发生，故毒沟褶菌中毒学说亦不足以解释YNSUD 的死亡原因。

某年7 月，云南省某地发生了一起家庭聚集性死亡案件，一个五口之家中的3 名女性（相互间均具有血缘关系）在48 h 内先后死亡，过程急骤，且3 名死者均在发病后1 h内死亡[9]。该事件由多领域专家会诊后一致认定为典型YNSUD 事件[10]。经对死者进行尸体解剖和对幸存者进行生化指标检测，均未能解释死因。经全基因组重测序，虽然发现死者存在3-羟酰基辅酶A 脱氢酶（3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，HADH；rs74428123，c.99C＞G，p.I33M）、蛋白激酶A 锚定蛋白9（A kinase anchoring protein 9，AKAP9；rs146797353，c.1204G＞A，p.A1276G）等可能致病的基因变异，但是单独从基因突变的角度难以解释该事件发生的时间、空间聚集性[10]。经深入调查，发现该家庭曾食用过当地野生菌。因此，本研究拟对该案中涉及的野生菌毒性进行探讨，以期发现YNSUD 的死因，为防治YNSUD提供帮助。

1 材料与方法

1.1 样本

在猝死发生地采集该家庭成员事发前曾食用的4 种野生菌，每种1 kg。4 种野生菌在当地的名称分别是“酸菌”“青头菌”“麻母鸡菌”“黄见手青”。

1.2 主要仪器和试剂

ZKF030 电热真空干燥箱（绍兴市银河机械仪器有限公司），S203 电子分析天平（意大利BEL Engineering 公司），5415D 高速离心机（德国Eppendorf 公司），XZ-1 抽滤系统（上海靳澜仪器制造有限公司），Hei-VAP Advantage 旋转蒸发仪（德国Heidolph 公司），JC-SHP-30 隔水式恒温培养箱（青岛聚创环保集团有限公司），ELx800 全自动酶标仪（美国BioTek 公司），HH-2 恒温水浴锅（杭州恒仪仪表科技有限公司），CKX41 倒置相差显微镜（日本Olympus 公司）。

HEK293 细胞（湖南丰晖生物科技有限公司），DMEM 高糖培养基、胎牛血清、双抗、Opti-MEM 减血清培养基（美国Thermo Fisher Scientific 公司），风味蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司）。细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒（Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST）均购自东仁化学科技（上海）有限公司。

1.3 野生菌种属鉴定

本研究采集的4 种野生菌，首先由中国科学院昆明植物研究所进行形态学鉴定。然后，每种野生菌随机挑选3 株子实体，切取菌柄和菌盖连接部分0.1 g，使用离心柱法提取基因组DNA，采用真菌核糖体rDNA内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增rDNA部分序列，然后对其进行测序。测序结果上传至BLAST网站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中检索其与数据库中其他真菌核酸序列的相似度，序列相似度最高的真菌即为鉴定结果[11-13]。

1.4 野生菌3 种浸膏的制备

挑选新鲜的野生菌，剔净泥土杂质，称重，定量1 kg，切成2 mm 厚的薄片，摊开置于宣纸上，放入电热真空干燥箱37 ℃烘干过夜，制成干品。用电动打粉机将干品打成粉末，过50 目筛，制成干粉[14]。

第1 种：称取5 g 野生菌干粉置于100 mL 圆底烧瓶中，加入60 mL 50%乙醇溶液，超声波处理器萃取30 min，反复萃取3 次，抽滤提取液。将提取液置于旋转蒸发仪中，温度维持在60 ℃，溶剂蒸发完全后制得野生菌生品浸膏。

第2 种：称取5 g 野生菌干粉置于100 mL 烧杯中，加入100 mL 蒸馏水，电煮锅加热煮沸10 min，浓缩至60 mL，加入60 mL 无水乙醇。超声波处理器萃取30 min，反复萃取3 次，抽滤提取液。将提取液置于旋转蒸发仪中，温度维持在60 ℃，溶剂蒸发完全后制得野生菌熬煮浸膏。

第3 种：称取5 g 野生菌干粉置于100 mL 烧杯中，加入100 mL 蒸馏水，电煮锅加热煮沸10 min，补足蒸馏水至100 mL，然后加入1 g 风味蛋白酶，将混合物搅拌均匀后分装至3 支50 mL 的离心管中，置于56 ℃恒温水浴锅过夜（约16 h），其间多次振荡，后转移至100 mL 烧杯中，加入1 mL 40%浓盐酸溶液混匀，56 ℃水浴加热搅拌30 min，挥发多余盐酸，微波炉加热煮沸10 min，灭活蛋白酶，浓缩至60 mL，加入60 mL 无水乙醇。超声波处理器萃取30 min，反复萃取3 次，抽滤提取液。将提取液置于旋转蒸发仪中，温度维持在60 ℃，溶剂蒸发完全后制得野生菌熬煮后酶解浸膏[15]。

1.5 细胞毒性实验

复苏HEK293 细胞，用DMEM 高糖培养基、胎牛血清、双抗按90∶10∶1 的体积比配制成的培养基进行培养，培养环境温度为37 ℃，CO2浓度为5%。待铺板面积达90%后接种至96 孔板，每孔100 μL，接种密度约为1×105/mL。恒温培养箱培养至细胞铺满96 孔板后，更换减血清培养基（1%胎牛血清）饥饿处理8 h 后再进行后续操作。

对4 种野生菌的生品浸膏分别设置0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/mL质量浓度梯度干预HEK293 细胞，同时设置空白对照组，每个质量浓度设3 个复孔，干预24 h 后，进行CCK-8 检测，筛选出有细胞毒性的野生菌以及适合的浓度区间。筛选出的有细胞毒性的野生菌增加熬煮和熬煮后酶解的浸膏制备方式，进一步检验常规烹制和烹制后消化是否可以减毒。

将筛选出的野生菌制备成生品浸膏、熬煮浸膏、熬煮后酶解浸膏，溶解后稀释为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL质量浓度梯度干预HEK293细胞，同时设置空白对照组，每个质量浓度设3 个复孔。干预24 h 后，取细胞培养液100 μL 至新的96 孔板，用于LDH 检测，向96 孔板中再次加入减血清培养基100 μL，用于CCK-8 检测。

CCK-8 细胞毒性实验与LDH 检测均属于测定细胞毒性的高灵敏度比色检测法。CCK-8 试剂可与活细胞内的脱氢酶生成水溶性有色甲臜，通过检测甲臜染料在450 nm 处的吸光度可以检测活细胞数量，细胞增殖越多、越快，则颜色越深，反之，则颜色越浅。LDH 检测试剂盒中的无色水溶性四唑盐（watersoluble tetrazolium，WST）可与受损细胞所释放出的LDH反应生成橙黄色甲臜，通过检测甲臜染料在490 nm处的吸光度可以测定死细胞和受损细胞的数量，甲臜产物的吸光度值与LDH 的量成正比。CCK-8 细胞毒性实验与LDH 检测法所产生的有色物质的颜色深浅由酶标仪检测，以吸光度的形式表示。结合CCK-8细胞毒性实验与LDH 检测法可以同时测定浸膏干预后活细胞和死细胞的数量，更全面地表征细胞毒性。将不同质量浓度（0.1、0.5、1.0、5.0 mg/mL）的有毒野生菌浸膏干预后的细胞放于倒置相差显微镜下观察，对细胞形态、数量和特征性变化进行描述并拍照。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 4 种野生菌的种属鉴定结果

采集的4 种野生菌（图1）经中国科学院昆明植物研究所鉴定，“酸菌”为美味牛肝菌（Boletus edulis），“青头菌”为变绿红菇（Russula virescens），“麻母鸡菌”为隐花青鹅膏（Amanita manginiana），“黄见手青”为粉黄黄肉牛肝菌（Butyriboletus roseoflavus）。

图1 本案涉及的4 种野生菌Fig.1 The 4 wild mushrooms involved in the case

野生菌测序结果显示：“青头菌”“麻母鸡菌”和“黄见手青”样本与参考序列的相似度均大于99%，可直接鉴定种属，“青头菌”样本为变绿红菇，“麻母鸡菌”样本为隐花青鹅膏，“黄见手青”样本为粉黄黄肉牛肝菌[16-17]；“酸菌”样本与参考序列的相似度不足99%，但考虑到“酸菌”样本与美味牛肝菌的基因相似度最高，仍可达96.65%，尚可认为是美味牛肝菌。

2.2 4 种野生菌生品浸膏的细胞毒性检测结果

采用CCK-8 检测4 种野生菌生品浸膏对HEK293细胞的毒性实验初步筛选出可能有毒的野生菌为隐花青鹅膏。在质量浓度为0.1 mg/mL 时，隐花青鹅膏生品浸膏干预孔的吸光度值较空白对照孔降低，即产生细胞毒性，随着质量浓度的增加，细胞毒性逐渐增强。其他3 种野生菌生品浸膏干预孔的吸光度值未见明显变化，详见表1。

表1 CCK-8 法检测4 种野生菌生品浸膏对HEK293 细胞的毒性Tab.1 Cytotoxicity of raw extracts of 4 wild mushrooms to HEK293 cells detected by CCK-8 ［n=3，，L/（g·cm）］

注：1）0 为空白对照组的质量浓度；2）与空白对照组比较，P＜0.05。

2.3 隐花青鹅膏3 种浸膏的细胞毒性实验结果

CCK-8 细胞毒性实验结果显示：隐花青鹅膏生品浸膏在质量浓度为0.1 mg/mL 时对HEK293 细胞有毒性，熬煮浸膏在质量浓度为0.4 mg/mL 时对HEK293 细胞有毒性，熬煮后酶解浸膏在质量浓度为0.7 mg/mL时对HEK293 细胞有毒性，详见表2。

表2 CCK-8 法检测隐花青鹅膏3 种浸膏对HEK293 细胞的毒性Tab.2 Cytotoxicity of 3 kinds of Amanita manginiana extracts to HEK293 cells detected by CCK-8 ［n=3，，L/（g·cm）］

注：1）0 为空白对照组的质量浓度；2）与空白对照组比较，P＜0.05。

LDH 检测法检测细胞毒性结果显示：隐花青鹅膏生品浸膏在质量浓度为0.2 mg/mL 时对HEK293 细胞有毒性，熬煮浸膏在质量浓度为0.6 mg/mL 时对HEK293 细胞有毒性，熬煮后酶解浸膏在质量浓度为0.7 mg/mL 时对HEK293 细胞有毒性，详见表3。

表3 LDH 检测法检测隐花青鹅膏3 种浸膏对HEK293 细胞的毒性Tab.3 Cytotoxicity of 3 kinds of Amanita manginiana extracts to HEK293 cells detected by LDH Assay Kit ［n=3，，L/（g·cm）］

注：1）0 为空白对照组的质量浓度；2）与空白对照组比较，P＜0.05。

2.4 隐花青鹅膏3 种浸膏干预后HEK293 细胞的形态变化

将不同质量浓度的隐花青鹅膏3种浸膏对HEK293细胞进行干预，观察HEK293 细胞的形态变化，结果显示：质量浓度为0.1 mg/mL 时，仅发现生品浸膏组细胞数量稍有降低。质量浓度为0.5 mg/mL时，生品浸膏组和熬煮浸膏组细胞体积稍增大，突触略有增多，细胞数量稍有降低；熬煮后酶解组细胞未见明显变化。质量浓度为1.0 mg/mL 时，生品浸膏组和熬煮浸膏组细胞数量均明显减少，生品浸膏组细胞突触增多，折光性较差，熬煮后酶解组细胞数量也略有减少，但形态未发生明显变化。质量浓度为5.0 mg/mL时，生品浸膏组细胞几乎全部死亡，镜下可见细胞大片溶解、死亡，呈透明小球或碎片状漂浮于培养基中；熬煮浸膏组细胞数量减少了约70%，存活细胞折光性差，边界不清晰，突触增加且有延长；熬煮后酶解组细胞数量明显减少，细胞也有突触增多的现象。详见图2。

图2 隐花青鹅膏3 种浸膏干预后HEK293 细胞的形态学改变（×100）Fig.2 Morphological changes of HEK293 cells after intervention with 3 kinds of Amanita manginiana extracts（×100）

3 讨论

云南不明原因猝死（曾用名“云南暴发性病毒性心肌炎”“云南不明原因心源性猝死”“云南地方性猝死”）是一种发生于云南一些偏远山区和半山区的具有时间、空间聚集性的特殊不明原因猝死。陆步来等[2]的研究发现，1975 年在云南省华宁县首次报道了3 例猝死病例后，在云南各地相继出现此类猝死病例，先后有23 个县（区）报告了375 例此类猝死病例。YNSUD严重影响了病区的社会安定和正常生产、生活秩序，是云南省目前较为严重的地方性公共卫生问题。

云南盛产野生菌，在各地区均广泛采食，每年6～9 月野生菌大量出土，与此同时，野生菌中毒案件频发。食用野生菌和YNSUD 案件发生在时间、空间上存在一定的吻合，提示野生菌中毒和YNSUD 之间可能存在某种联系。本起案件中，五口之家中的3 名女性在48 h 内先后死亡，死亡过程急骤，主要症状为突然的意识丧失伴抽搐，3 名受害者均在发病后1 h 内死亡，通过对其中2 名死者进行系统尸体检验、常规毒（药）物检验和组织病理学检验，发现两人仅偶见小灶性心肌变性及炎症细胞浸润，不能以此认定死因，常规毒（药）物检验结果均为阴性。虽然家庭中另外2名男性幸存者的血清生化指标显示部分心肌酶和肝酶非特异性轻度升高，但是2 d 后即恢复正常，因此认为系应激所致[9]。仅从自身疾病或基因突变的角度，难以解释该事件中3 人先后于48 h 内发生死亡的时间和空间聚集性，这提示可能存在共同的暴露因素。

通过回顾调查死者家庭食谱，发现该家庭于事发前进食过当地认为无毒的野生菌。同一种野生菌可能由于地域差异，其基因组也会有部分差异；季节、生长环境差异以及处于不同生长期的子实体也可能导致其子实体内的化合物及微量元素有明显差异，其毒性也可能不同[18-19]。所以，本研究对该事件中涉及的野生菌进行了毒性研究。因为肝肾损害是蘑菇中毒致死的主要机制，同时考虑到人胚肾细胞（HEK293细胞）是毒性实验常用细胞，故本研究选用其进行细胞毒性实验[20-21]。

该起案件中食用的4 种野生菌样本均采自事发当地，通过形态学特征及基因测序鉴定种属。4 种野生菌均属于真菌门（Eumycota）、担子菌亚门（Basidiomycotina）、担子菌纲（Basidiomycetes）、伞菌目（Agaricales），其中粉黄黄肉牛肝菌、美味牛肝菌属于牛肝菌科、牛肝菌属，变绿红菇属于红菇科、红菇属，隐花青鹅膏属于鹅膏菌科、鹅膏菌属。本次事件中食用的粉黄黄肉牛肝菌曾被报道为低毒性，中毒症状包括典型的精神症状、幻视以及胃肠道症状，但尚未见中毒致死的案件报道，并且其充分加热烹制可以完全灭毒[22-23]。本研究中，在1.0 mg/mL 的生品浸膏干预下，粉黄黄肉牛肝菌并未显示出明显细胞毒性，说明其生品浸膏在此剂量下不具有细胞损伤毒性，因此认为该起案件与食用粉黄黄肉牛肝菌无关。针对美味牛肝菌和变绿红菇的研究较多，但尚未发现其具有明显毒性，本实验也支持这一观点。隐花青鹅膏虽然属于鹅膏属，但不同于大众所熟知的剧毒鹅膏，目前该菌被学界定义为可食用野生菌，相关的研究相对较少。陈作红等[21，24]对我国28 种鹅膏菌进行6 种常见鹅膏肽类毒素检测，未在隐花青鹅膏中检出鹅膏肽类毒素，但本实验中，在1.0 mg/mL 的生品浸膏干预下，隐花青鹅膏显示出明显细胞毒性，这提示隐花青鹅膏可能存在常见鹅膏毒肽以外的其他毒素。

本研究还对隐花青鹅膏增加了熬煮、熬煮后酶解两种浸膏制作方法，分别模拟当地居民对野生菌的常见烹制方式和烹制后进食消化过程，发现隐花青鹅膏的3 种浸膏对HEK293 细胞均有明显毒性，并呈剂量依赖。CCK-8 法检测出的隐花青鹅膏中毒量为生品浸膏≥0.1 mg/mL、熬煮浸膏≥0.4 mg/mL、熬煮后酶解浸膏≥0.7 mg/mL，LDH 检测法筛选出的隐花青鹅膏中毒量为生品浸膏≥0.2 mg/mL、熬煮浸膏≥0.6 mg/mL、熬煮后酶解浸膏≥0.7 mg/mL。两种方法均能有效验证3 种浸膏对HEK293 细胞的毒性，结果上的少许偏差可能是3 种浸膏溶液自身的颜色影响了细胞培养液的吸光度值。本研究中虽然熬煮浸膏的中毒剂量较生品浸膏增加，但当熬煮浸膏质量浓度≥0.6 mg/mL 时，其细胞毒性与生品浸膏相近，所以熬煮并不能完全减毒；熬煮后酶解浸膏质量浓度≥0.7 mg/mL 时也显现出细胞毒性，同样不能完全减毒。野生菌的活性成分极其丰富，主要包括多糖、生物碱、萜类化合物、蛋白质以及维生素、有机酸等物质[25]。本研究中，隐花青鹅膏的活性成分采用有机溶剂提取，且在高温和酶解处理后活性降低，初步判断此活性物质可能是蛋白质类或萜类化合物，具体物质有待分离、纯化和结构分析确定。

综上，本研究通过对一起典型YNSUD 案件的环境暴露因素进行分析，揭示了隐花青鹅膏提取物具有明显的细胞毒性，且加热、酶解处理无法完全灭毒，故食用该菌存在一定的安全隐患。隐花青鹅膏的分布与YNSUD 疫区存在多大程度的重叠以及隐花青鹅膏是否存在心肌毒性等问题还有待后续调查和实验研究解决。