人参PgWRKY22基因的克隆及在磷胁迫下的表达分析

梁 浩，孙 海，邵 财，钱佳奇，张亚玉, 2*

• 药材与资源•

人参基因的克隆及在磷胁迫下的表达分析

梁 浩1，孙 海1，邵 财1，钱佳奇1，张亚玉1, 2*

1. 中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112 2. 成都大学药学与生物工程学院，四川 成都 610106

克隆人参转录因子基因，进行生物信息学、亚细胞定位及外源磷胁迫表达分析。根据人参转录组数据库设计特异性引物，PCR扩增全长cDNA序列，命名为，并对其进行生物信息分析；构建绿色荧光融合表达载体PgWRKY22-eGFP，利用农杆菌侵染烟草叶片的瞬时表达法分析亚细胞定位；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测在人参组织中的表达特异性以及在外源磷作用下的表达模式。人参转录因子基因的cDNA序列为975 bp，编码324个氨基酸；PgWRKY22蛋白属于WRKY超家族蛋白，具有典型的WRKY结合域，该蛋白不稳定，属于亲水性蛋白，无规则卷曲为主要组成部分；PgWRKY22蛋白与丹参SmWRKY、葡萄VvWRKY22、长春花CrWRKY22、独脚金SaWRKY27蛋白具有较高的同源性，与西洋参PqWRKY1、PqWRKY2，人参PgWRKY1、PgWRKY3、PgWRKY4具有较近的系统发育关系；亚细胞定位显示PgWRKY22定位于细胞核上；qRT-PCR表明在人参的侧根和主根中表达较高，在叶和茎中次之；在外源磷浓度为2 mmol/L下的表达显著高于其他磷浓度下的表达。克隆获得的cDNA序列及表达信息，可为后续进行基因功能鉴定和人参栽培的磷营养调控提供参考。

人参；转录因子；生物信息学；亚细胞定位；表达分析

人参C. A. Meyer为五加科多年生草本植物，具有“百草之王”的美誉，作为珍贵的药用植物在中国、韩国、日本等国颇受欢迎。人参的生物活性成分包括皂苷、多糖、多肽等，其中人参皂苷作为人参的主要活性成分，由于其独特的药理功效及在保健食品中的应用潜能，目前已被广泛研究[1]。人参的有效成分为次生代谢产物，其生物合成和积累过程受到植物生长环境中各种生物和非生物胁迫的调节[2]。在这些环境胁迫中，植物体内的相关基因会启动表达，以此来适应逆境[3]。

转录因子在植物应对各种生物和非生物胁迫的响应中发挥着关键作用[4]。WRKY是一类重要的转录因子，广泛参与植物的发育和逆境响应[5]。WRKY蛋白在N端含有保守的WRKYGQK延伸，在C端含有锌指基序Cx4-5Cx22-23HxH或Cx7Cx23HxC[6]。WRKY根据其结构可分为3类（I、II和III）[7]。WRKY蛋白通过与启动子区域的W-box元件（T）TGAC（C/T）特异性结合来调控靶基因的转录，这些序列元件（T）TGAC（C/T）包含响应生物胁迫转录反应的TGAC核心序列，所以TGAC核心序列被认为是在启动子区域响应植物参与防御相关基因的启动表达。大量的体内和体外结合实验已证明WRKY结构域和W-box之间的相互作用以响应植物生长发育和各种生物或非生物胁迫反应。随着高通量技术的发展，在植物中参与生长发育和逆境响应的WRKY型转录因子已从多种植物中鉴定出来，其中拟南芥中有74个，水稻中有103个，双穗短柄草中有86个，大豆中有197个，菠萝中有54个[8]。此外，WRKY型转录因子参与植物生长发育和逆境响应的机制也被进一步研究。例如，在拟南芥中，可以部分介导GA3对拟南芥开花时间和次生壁形成的调控作用[9-11]；、、、参与叶片衰老的调控[8, 12-14]。在水稻中，通过调节下游靶基因正向调控水稻的耐寒性[15]。在葡萄中，过表达系在盐胁迫下具有较高的抗氧化活性和较低的活性氧含量，从而增强了其对盐胁迫的抗性[16]。在大豆的全基因组鉴定中发现，66个响应盐胁迫的表达模式不同，其中12个无显著变化，35个下调，19个上调[17]。

磷是植物必需的大量营养元素，在植物中参与多种代谢过程，对其生长发育起着至关重要的作用。植物对磷环境的适应包括形态生理基础和基因表达调控[18]。例如，磷转运体的调控，氨基酸及衍生物、类黄酮、磷酸酶的分泌以及根结构的改变[19]。磷的代谢途径受多种基因调控，在不同的磷条件下，这些基因的表达也不同[20]。如在水稻中，低磷反应的主要转录调节因子OsPHR2（phosphate starvation response 2）通过激活磷饥饿诱导的基因（phosphate transporter 1）与基因启动子区域中的P1BS（PHR1结合序列：GNATATNC）基序结合[21-22]，以此来调控对磷环境的适应[23-28]。也有研究在玉米[29]、大豆[30]、黑麦草[31]、大麦[32-33]和小麦等作物中分析了植物对磷胁迫反应的分子机制[34]。由于WRKY型转录因子具有W-box（含TTGAC序列）的蛋白特异识别元件，因此，在磷胁迫下也发现该类转录因子能够与磷转运相关基因启动子的W-box相结合，进而参与调控植物磷胁迫响应。在拟南芥中，、均能与基因启动子结合，进而参与磷胁迫响应；AtWRKYb、AtWRKYc、AtWRKY28 也参与 AtPHO1基因的表达调控，以响应磷饥饿过程；At WRKYd、AtWRKYe、AtWRKY42、At WRKY45等还可通过与磷转运体PHT1；1或PHT1；4的互作，参与拟南芥低磷胁迫的诱导响应[35-37]。此外，在水稻中过表达OsWRKY21和OsWRKY108能显著增加低磷胁迫条件下水稻体内磷的积累量，而将这2个基因突变则使水稻体内磷积累量显著减少[38]。水稻的OsWRKY75也有类似的功能，过表达OsWRKY75不仅能显著提高水稻对磷饥饿的耐受性，且使水稻根系和地上部的生物量以及磷含量均高于野生型[39]。鉴于WRKY在响应磷胁迫中的重要作用，本研究进行基因克隆，分析其亚细胞定位、组织表达及磷胁迫表达特征，为进一步研究WRKY型转录因子应答人参营养胁迫的分子机制提供科学依据。

1 材料与试剂

1.1 材料

二年生人参苗采自人参主产区吉林省抚松县人参种植基地，经中国农业科学院特产研究所张亚玉研究员鉴定为五加科草本植物人参C. A. Meyer。

1.2 试剂、载体及菌株

RNAsimple Total RNA Kit试剂盒（天根生物科技有限公司）；FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix试剂盒（天根生物科技有限公司）；2×Trans Taq®High Fidelity（HiFi）PCR SuperMixII（北京全式金生物科技有限公司）；TIANgel Midi Purfication Kit试剂盒（天根生物科技有限公司）；pEASY ®-T5 Zero Cloning Kit试剂盒（北京全式金生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 样品处理

将从种植基地所采的人参苗置于实验室的智能人工气候室（温度20，光照2000 lx）内使用不同磷浓度的霍格兰氏营养液进行水培，设置5个磷浓度水平处理：P0（0 mmol/L）、P1（0.5 mmol/L）、P2（1.0 mmol/L）、P3（2.0 mmol/L）、P4（4.0 mmol/L），每个处理3次重复，将人参苗水培至第8周1次性取样。

2.2 RNA提取与纯化

参照天根的RNAsimple Total RNA Kit试剂盒提取样品总RNA并纯化，采用微量核酸蛋白仪和琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。反转录参照天根生物有限公司的FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix试剂盒说明进行。

2.3 PgWRKY22基因的克隆及测序

基于本实验室前期经高通量测序所得的转录组数据库，筛选出基因为模板，利用DNAMAN和Primer Premier 6软件设计扩增引物（PgWRKY22-F：5’-ATGGGAGAATTTGTTAGTAT- GGAG-3’，PgWRKY22-R：5’-TTACCTAAAAT- GTTCCGTAGAGCA-3’）。以人参根茎cDNA为模板，配制反应体系：12.5 μL 2×Trans Taq ®High Fidelity（HiFi）PCR SuperMixII，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板1 μL，9.5 μL的ddH2O。PCR扩增反应程序为：95 ℃预变性4 min；95 ℃、30 s，51 ℃、30 s，72 ℃、90 s，进行35个循环；72 ℃、7 min。反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化回收PCR产物，使用pEASY ®-T5 Zero Cloning Kit试剂盒将目的片段连接到T5载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞涂板，挑取阳性菌株提取质粒送上海生工测序。

2.4 PgWRKY22基因的生物信息分析

将基因编码的氨基酸序列分别提交到NCBI和Protparam上在线分析其理化性质；SOPMA分析蛋白二级结构；采用SWISS-MODEL在线工具进行三维同源建模；TMHMM在线预测跨膜结构域；SMART在线分析保守结构域；利用DNAMAN软件对PgWRKY22与其他物种WRKY蛋白的氨基酸序列进行同源性分析；利用MEGA6.0软件构建PgWRKY22蛋白家族的系统进化树。

2.5 PgWRKY22基因的亚细胞定位

根据基因的CDS区设计含有EcoRI和XbaI酶切位点的引物（PgWRKY22-EcoRIF：5’-CATGGGAGAATTTGTTAGTA-3’；PgWRKY22-XbaIR：5’-CGCCTAAAATG- TTCCGTAGAG-3’；划线部分为酶切位点），通过同源重组方法连接至pCAMBIA2300-35S-eGFP载体的EcoRI和XbaI酶切位点之间，获得重组质粒pCAMBIA 2300-35S-eGFP-PgWRKY22，然后连接pEASY ®-T5载体转化大肠杆菌涂板，挑取阳性克隆进行测序验证。将测序正确的载体通过农杆菌GV3101介导注射烟草叶片，空载体作为对照同时注射烟草，然后将注射的烟草叶片制作成玻片，在激光共聚焦显微镜下观察eGFP信号。

2.6 PgWRKY22基因的组织及磷胁迫表达分析

使用LightCycler®96实时荧光定量PCR仪（瑞士）分析基因在人参不同组织中及磷胁迫下的表达模式。依据的CDS区设计qRT-PCR特异性引物（PgWRKY22q-F：5’-TCATTCGGTTCACTGGATTACA-3’；PgWRK- Y22q-R：5’-GCTCATCTAACTCATCCACAAG-3’），以为内参基因（GAPDH-F：5’-ATGGA- CCATCAGCAAAGGAC-3’；GAPDH-R：5’-GGT- AGCACTTTCCCAACAGC-3’）。反应体系为：FastStart Universal 2×SYBR Green（金佰特；北京）12.5 μL，上下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），cDNA模板1 μL，10.5 μL的dd H2O，同时以1μL的dd H2O代替模板作为阴性对照。反应程序：94 ℃、2 min；94 ℃、15 s，55 ℃、20 s，72 ℃、30 s，进行40个循环；72 ℃、7 min。每个样品分别设置3次技术性和生物学重复，采用2−ΔΔCt法[40]计算相对表达水平。

3 结果与分析

3.1 PgWRKY22基因的克隆及序列分析

基于实验室测序得到的转录组数据库设计扩增引物，以反转录的cDNA做模板进行PCR扩增，得到的扩增条带（图1）。将PCR产物切胶纯化回收并连接到pEASY®-T5载体，转化提质粒测序显示：基因的全长为975 bp，编码324个氨基酸（图2）。

M-Marker 1-PgWRKY22回收条带

方框分别代表起始密码子和终止密码子

3.2 PgWRKY22基因的生物信息学分析

3.2.1 PgWRKY22编码蛋白的理化性质及结构分析 将PgWRKY22编码的氨基酸序列分别提交到NCBI和Protparam上进行在线分析，结果显示其编码的蛋白属于WRKY超家族蛋白，具有WRKY DNA结合域（图3-A）。PgWRKY22编码蛋白的相对分子质量为36 539.53，理论等电点为5.17，分子式为C1616H2465N431O518S10，该蛋白的不稳定系数为49.75，属于不稳定蛋白。脂肪指数为64.69，总平均亲水性为−0.632，属于亲水性蛋白。SOPMA在线分析显示，PgWRKY22编码蛋白的二级结构包含85个α螺旋（25.63%），209个无规则卷曲（64.51%）、18个折叠形态延伸链（5.56%）以及12个β转角（3.70%），无规则卷曲是主要组成部分（图3-B）。利用SWISS-MODEL在线建立PgWRKY22蛋白的三维结构模型（图3-C）。TMHMM在线预测PgWRKY22蛋白的跨膜结构域显示该蛋白不含跨膜区域，属于非跨膜蛋白（图4-A）。SMART在线分析发现PgWRKY22蛋白具有2个结构域，分别是组成复杂性较低域和WRKY域（图4-B）。

3.2.2 PgWRKY22编码蛋白的同源性及系统进化树分析 将编码蛋白序列提交到NCBI数据库与其他植物的WRKY蛋白序列进行序列比对，发现PgWRKY22蛋白与丹参Bunge（AKA27922.1）、葡萄L.（RVX04199.1）、长春花(L.) G. Don（AFK88675.1）和独脚金(L.) Kuntze.（GER33041.1）中的WRKY蛋白具有较高的同源性（图5-A）。将PgWRKY22与人参和西洋参中的WRKY蛋白进行进化树分析显示，PgWRKY22蛋白与西洋参PqWRKY1、PqWRKY2，人参PgWRKY1、PgWRKY3、PgWRKY4具有较近的系统发育关系，与人参PgWRKY2，西洋参PqWRKY5、PqWRKY8关系较远（图5-B）。

图3 PgWRKY22编码蛋白的二级结构(A，B) 及三级结构预测(C)

3.3 PgWRKY22蛋白的亚细胞定位

为了确定该蛋白在细胞中的分布情况，构建pCAMBIA2300-35S-eGFP-PgWRKY22载体，并通过根癌农杆菌介导烟草叶片的瞬时转化体系，在激光共聚焦显微镜下观察发现eGFP-PgWRKY22融合蛋白在细胞核内具有明显的GFP信号（图6-A），对照组pCAMBIA2300-35S-eGFP载体在整个细胞中均能观察到GFP信号（图6-B），初步表明PgWRKY22蛋白定位在细胞核上。

图4 PgWRKY22编码蛋白的跨膜结构域(A) 和保守结构域分析(B)

3.4 PgWRKY22基因的组织表达及磷胁迫表达分析

为进一步分析的表达模式，采用天根的RNAsimple Total RNA Kit试剂盒提取人参的主根、侧根、茎、叶以及不同磷处理的侧根组织的RNA，反转录为cDNA后作为模板，通过qRT-PCR技术检测在不同组织和不同磷浓度下的表达量。实验结果表明，在人参的主根、侧根、茎和叶组织中均有表达，但表达存在明显的差异，在侧根和主根中的表达量最高，其次是叶，在茎中的表达量最低（图7-A）。在外源磷处理下，各部位在P3（2.0 mmol/L）浓度下表达量最高，P4（4.0 mmol/L）浓度下次之，在P0（0 mmol/L）、P1（0.5 mmol/L）和P2（1.0 mmol/L）浓度下表达量相对较低（图7-B）。

4 讨论

植物在生长发育过程中会遭受各种生物或非生物胁迫，这些环境胁迫会影响植物体内的转录和代谢过程，尤其在药用植物中会影响有效成分的形成和积累，而植物为了避免和缓解各种胁迫，便会启动一系列的基因进行表达调控，在这些调控中，WRKY型转录因子发挥了重要作用。本研究通过人参转录组数据库克隆了一个人参WRKY型转录因子基因，该基因编码324个氨基酸，具有典型的WRKY保守结构域，该基因编码蛋白与丹参、葡萄、长春花和独脚金中的WRKY家族蛋白成员具有较高的同源性，而目前在丹参和葡萄中也有较多关于WRKY型转录因子的研究，如丹参SmWRKY14、SmWRKY40、SmWRKY44等[41-43]；葡萄VvWRKY54、VvWRKY48等[44-45]。

图5 PgWRKY22与其他植物氨基酸序列比对(A) 和进化树分析(B)

A-pCAMBIA2300-35S-eGFP-PgWRKY22载体 B-pCAMBIA2300-35S-eGFP载体

已有研究从人参中鉴定并克隆了9个WRKY型转录因子（PgWRKY1～9），并确定了这9个WRKY型转录因子在水杨酸、脱落酸、NaCl和茉莉酸甲酯处理下的表达模式[46-47]。基于进化树分析呈现的PgWRKY22蛋白与PgWRKY1、PgWRKY3、PgWRKY4具有较近的系统发育关系，比较了PgWRKY22蛋白与PgWRKY1、PgWRKY3、PgWRKY4在盐胁迫下的表达特征，即使用磷酸盐处理能诱导的表达，这与使用NaCl处理诱导、、的表达结果相似，但前人研究还表明茉莉酸甲酯处理能下调、、的表达，因此，当植株受到钠盐或磷酸盐胁迫时，通过茉莉酸甲酯处理可能是一种有效的缓解途径，但这仍然需要进一步的实验去证实。

不同字母表示经多重t检验分析各组间差异显著（P＜0.05）

WRKY型转录因子是一种细胞核靶向蛋白且具有组织特异性[48-49]。在人参中已鉴定了1个WRKY型转录因子，亚细胞定位表明PgWRKY1定位于细胞核，是一种核定位蛋白，在各种组织中的表达分析表明，与叶、茎和种子相比，它优先在侧根和根中表达[46]。本研究结果也显示，PgWRKY22属于一种核定位蛋白，并与PgWRKY1具有较近的系统进化关系，且在侧根和主根中的表达优先于在叶和茎中的表达。这些结果显示在各种组织中广泛表达，表明它可能在人参器官组织的多个发育阶段发挥调节作用，且可能对人参的高价值根具有重要意义。

基因表达分析是了解基因可能的生物学功能所必需的[50]。磷已被证明影响许多基因的表达，调节植物的多种发育过程以及植物对逆境的反应。最典型的便是（无机磷酸盐转运蛋白1）基因，在拟南芥中，AtPHT1、AtPHT5在衰老叶片的维管束韧皮部中表达，介导磷从源向库器官的再分配[51-52]。除了基因，在高等植物中，许多转录因子也参与了磷信号途径，如拟南芥中的、、，水稻中的、、等[39, 53-55]。此外，WRKY型转录因子也被报道参与低磷胁迫响应，在拟南芥中有、、、，在水稻中有[56-60]。本实验研究了的表达谱是否与磷胁迫有关，根据研究结果显示，转录本的表达在P3（2.0 mmol/L）和P4（4.0 mmol/L）磷浓度下显著上调，且表达从P0（0 mmol/L）浓度至P3（2.0 mmol/L）浓度呈上升趋势，从P3（2.0 mmol/L）浓度至P4（4.0 mmol/L）浓度呈下降趋势。这与拟南芥和水稻等植物中低磷诱导相关WRKY型转录因子表达上调相比，似乎呈现出一种相反的趋势，因此，推测可能是一个高磷诱导表达的转录本，而不是受低磷诱导，但这仍需要进一步通过基因功能研究去证实。

综上所述，本研究克隆了1个人参WRKY型转录因子基因，该基因主要在人参根中表达，且编码的蛋白可能参与磷胁迫相关途径。虽然的基因功能仍需要进一步通过实验验证，但本研究可为深入探究该基因参与人参代谢途径中元素转运的分子机制提供理论基础，同时也为在人参健康栽培中开展营养调控提供重要参考。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Molecular cloning offromand its expression in response to external phosphorus supply

LIANG Hao1, SUN Hai1, SHAO Cai1, QIAN Jia-qi1, ZHANG Ya-yu1, 2

1. Institute of Special Animal and Plant Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130112, China 2. College of Pharmacy and Biological Engineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China

To clone a transcription factor genefromfollowed by bioinformatics, subcellular localization and expression in response to external phosphorus supply were performed.According totranscriptome database to design the specific primer, by PCR to amplify the cDNA sequence of, which was named as, and its bioinformatics was analyzed. Enhanced green fluorescent protein (eGFP) fused expression vector PgWRKY22-eGFP was constructed and subcellular localization of PgWRKY22 was observed bytransient expression method in tobacco. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression specificity ofin plant tissues and its expression in response to external phosphorus supply.The cDNA sequence of thetranscription factor genewas 975bp, encoding 324 amino acids; PgWRKY22 protein was a WRKY superfamily protein with a typical WRKY binding domain. It was an unstable hydrophilic protein with random coils as its main component; PgWRKY22 protein has high homology withSmWRKY,VvWRKY22,CrWRKY22,SaWRKY27 protein, and has a close phylogenetic relationship withPqWRKY1, PqWRKY2,PgWRKY1, PgWRKY3, PgWRKY4; subcellular localization shows that PgWRKY22 was localizted to the nuclei; real-time fluorescence quantitative PCR showed thatwas highly expressed in the lateral roots and main roots of, followed by the leaves and stems; the expression at exogenous phosphorus concentration of 2 mmol/L was significantly higher than that at other phosphorus concentrations.The cDNA sequence and expression information ofwere obtained by cloning, which could provide reference for gene function identification and phosphorus nutrition regulation incultivation.

Panax ginseng C. A. Meyer; transcription factor; bioinformatics; subcellular localization; expression analysis

R286.12

A

0253 - 2670(2023)13 - 4286 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.021

2023-02-03

财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系（CARS-21）；中国农业科学院科技创新工程协同创新任务（CAAS-XTCX20190025-6）；国家重点研发计划项目子课题（2021YFD1600902）；非林地老参地再利用研究与示范项目（LNFYZBDL-JL18-246C）

梁 浩（1991—），男，博士研究生，研究方向为药用植物栽培。E-mail: 380278954@qq.com

通信作者：张亚玉，研究员，研究方向为药用植物栽培。E-mail: zyy1966999@sina.com

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