入山虎不同提取部位抗类风湿性关节炎活性研究

曾英港，王柳萍, 2, 3*，奉建芳, 2, 3*，唐丹丹，蒙泔竹

入山虎不同提取部位抗类风湿性关节炎活性研究

曾英港1，王柳萍1, 2, 3*，奉建芳1, 2, 3*，唐丹丹1，蒙泔竹1

1. 广西中医药大学，广西 南宁 530200 2. 江西中医药大学，江西 南昌 330004 3. 广西优势中成药与民族药开发工程技术研究中心，广西 南宁 530020

考察入山虎var.不同提取部位对类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的治疗作用及提取部位的化学成分分析。考察入山虎不同提取部位对人RA成纤维样滑膜MH7A细胞增殖活性和炎症因子含量的影响，通过对大鼠足趾部皮内注射完全弗氏佐剂建立RA大鼠模型，测定大鼠体质量、全身评分、关节炎指数、足跖肿胀度、脏器系数、血清中炎症因子含量，采用苏木素-伊红染色观察踝关节组织病理，以评价入山虎不同提取部位的抗RA活性作用。采用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析入山虎提取部位的化学成分。入山虎中的氯仿及石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水提取部位在体内外对RA均具有良好的抗炎作用。在体外，能够抑制MH7A细胞的增殖（＜0.05、0.01），减少炎症因子白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-17A、IL-1β的分泌（＜0.01）；在体内，入山虎的提取部位可不同程度降低RA大鼠的足跖肿胀度、全身评分及关节炎评分（＜0.05、0.01），改善踝关节的病理改变，缓解RA大鼠的炎症反应，还能减少促炎因子IL-6、IL-17A、IL-1β的分泌（＜0.01），增加抗炎因子IL-4、IL-10的分泌（＜0.01）。对入山虎的提取部位进行化学成分分析，发现入山虎的提取物含有的化合物比较相似，含有生物碱、黄酮、香豆素等其他化合物，以生物碱类居多，主要包括呋喃喹啉类、苄基异喹啉类、原小檗碱类、阿朴啡类、苯并菲啶类、酰胺类等。入山虎中的氯仿及石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位在体内外对RA均具有良好的抗炎作用，入山虎提取物主要含有生物碱、黄酮、香豆素等其他化合物。

入山虎；不同提取部位；类风湿性关节炎；炎症因子；生物碱；黄酮；香豆素；木兰花碱；橙皮苷；两面针碱

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的、病因未明的慢性自生免疫性疾病，病理学表现为滑膜增生，血管翳形成、炎症细胞浸润、软骨侵蚀等，临床表现为关节功能降低、关节疼痛、肿胀，最终造成关节畸形或者严重的残疾[1-3]。目前，RA治疗药物主要为非甾体抗炎药、改善风湿病情的药物、糖皮质激素、生物制剂等，但这些药物价格昂贵且伴有心血管和胃肠道出血、肝肾毒性和生长抑制等不良反应[4-6]。我国民族医药、中药具有多成分、多靶点、不良反应小等特色优势，在临床及实验研究中许多活性成分和作用机制得到了证实，具有良好的应用前景[7-9]。

入山虎为芸香科植物毛叶两面针(Roxb.) DC. var.Huang的干燥根和茎[10]，是传统瑶药“五虎”“九牛”“十八钻”“七十二风”104种老班药之首药，临床使用量较大。具有清热解毒、消肿止痛、活血散瘀、杀虫止痒的功效，用于治疗风湿、RA、坐骨神经痛、胃痛、腹痛、牙痛、咽喉肿痛等。现代研究表明，入山虎含有生物碱、黄酮类等成分，具有抗菌、抗癌、抗炎、抗血栓等药理活性[11-14]。但入山虎作为常用的抗RA瑶族民间草药，其抗RA药效物质基础研究还很薄弱。因此，本实验以入山虎为研究对象，探讨其不同提取部位的抗RA活性，寻找活性较强的提取部位，并对入山虎的提取物进行化学成分分析，为入山虎的抗RA作用研究提供初步的科学依据，为抗RA药物的研发提供参考。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠，体质量180～220 g，6周龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（湘）2019-0004。动物饲养于广西中医药大学SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（桂）2019-0001，饲养环境相对湿度50%，温度（22±1）℃，光线控制12 h明暗交替，用标准颗粒饲料喂养并自由饮用灭菌水。动物实验经广西中医药大学伦理委员会批准（批准号DW20220526-114）。

1.2 细胞

人RA成纤维MH7A细胞（批号220303）购自北纳生物科技有限公司。

1.3 药材

入山虎药材样品购自广西壮族自治区来宾市金秀瑶族自治县桐木镇草药街，样品均经过广西中医药大学韦松基教授、朱意麟讲师鉴定为芸香科植物毛叶两面针(Roxb.) DC. var.Huang的干燥根或茎。

1.4 药品与试剂

DMEM培养基、0.25%胰酶-EDTA消化液、PBS（批号分别为8122082、2376021、8122063）购自美国Gibco公司；胎牛血清（批号T210420H501）购自赛业生物科技有限公司；青链霉素混合液（批号20211120）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批号814O035）购自北京索莱宝科技有限公司；MTT（批号917Q0514）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；重组人肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，批号031825）购自美国PEPROTECH公司；人白细胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）、IL-6、IL-1β ELISA试剂盒（批号分别为UX0728043972、UX08R02H5223、UX09PN026474）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；大鼠IL-6 ELISA试剂盒（批号MAN0016898）、大鼠IL-1β ELISA试剂盒（批号MAN0016903）、大鼠IL-4 ELISA试剂盒（批号MAN0016900）、大鼠IL-10 ELISA试剂盒（批号MAN0016902）、质谱纯的纯净水（批号W6-4）、甲醇（批号A456-4）、乙腈（批号A955-4）、甲酸（批号A117-50）购自赛默飞世尔科技公司；大鼠IL-17A ELISA试剂盒（批号CSB-E07451r）购自武汉华美生物工程有限公司；甲氨蝶呤（methotrexate，MTX，批号036200804）购自上海上药信谊药厂有限公司；完全弗氏佐剂（批号F5881）购自美国Sigma公司；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，批号20211004）购自天津市大茂化学试剂厂；对照品两面针碱（质量分数为99.81%）、二氢白屈菜红碱（质量分数为99.21%）、盐酸白屈菜红碱（质量分数为99.41%）、盐酸血根碱（质量分数为99.50%）、花椒碱（质量分数为99.94%）、毛两面针素（质量分数为99.91%）、白鲜碱（质量分数为99.98%）、盐酸巴马汀（质量分数为98.75%）、盐酸药根碱（质量分数为99.50%）、木兰花碱（质量分数为99.82%）、橙皮苷（质量分数为98.88%）均购自成都曼思特生物科技有限公司，批号依次为MUST-22111707、MUST-22032004、MUST-21101002、MUST-23022212、MUST-21101701、MUST-22121906、MUST-22100807、MUST-21022604、MUST-23022212、MUST-22020816、MUST-21042811；对照品茵芋碱（质量分数为99.62%）、盐酸四氢巴马汀（质量分数为99.97%）、飞龙掌血素（质量分数为99.50%）均购自成都普瑞法科技开发有限公司，批号分别为PRF10081202、PRF21102042、PRF20082821；去甲乌药碱对照品（质量分数为97.00%，批号Y-115-150716）购自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.5 仪器

RE-5205型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；Alpha 2-4 LSCbasic型冰冻干燥机（德国Main Christ公司）；MCO-18AIC型CO2培养箱（三洋电机株式会社）；CK40型倒置显微镜（奥林巴斯株式会社）；SW-CJ-1FD型垂直净化工作台（苏州净化设备有限公司）；ST16R型低温离心机、Multiskan Sky全波长酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；MH-2型微型震荡器（其林贝尔仪器制造有限公司）；SL01-1型游标卡尺（德清盛秦芯电子科技有限公司）。UPLC-H CLASS超快速液相色谱、XEVO-G2 S qtof四极杆飞行时间质谱、Savant™ SPD131DDA SpeedVac™真空离心浓缩仪、Masslynx质谱数据采集软件（美国Waters公司）。

2 方法

2.1 入山虎不同提取部位的制备

取入山虎根、茎粗粉8.5 kg于渗漉筒铺平，加入10倍量0.8%稀盐酸，浸渍3 d，渗漉，收集提取液，合并，加入氨水调节pH至10，抽滤得到生物碱沉淀，同时将滤液减压浓缩，再用三氯甲烷根据生物碱的脂溶性将其萃取到氯仿层中，得到氯仿部位（总生物碱提取物）。

取8.5 kg入山虎根、茎粗粉用10倍量70%乙醇同上法渗漉，浓缩，得乙醇总提取物浸膏。按1∶2向乙醇总提取物浸膏中加入蒸馏水混悬，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇对混悬液萃取，浓缩，即得石油醚部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位的提取物。

2.2 入山虎不同提取部位的体外抗RA活性研究

2.2.1 MTT检测MH7A细胞增殖活性 取对数生长期的MH7A细胞，以5×103个/mL接种于96孔板，每孔100 μL，待细胞贴壁生长24 h后，给药组分别加入不同质量浓度的氯仿提取液（终质量浓度为25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5、0.781 3、0.390 6 mg/mL），石油醚、水部位提取液（终质量浓度为6.250 0、3.125 0、1.562 5、0.781 3、0.390 6、0.195 3、0.097 7 mg/mL），醋酸乙酯部位提取液（终质量浓度为12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5、0.781 3、0.390 6、0.195 3 mg/mL），正丁醇部位提取液（终质量浓度为3.125 0、1.562 5、0.781 3、0.390 6、0.195 3、0.097 7、0.048 8 mg/mL），同时设置阴性对照组（有细胞、培养基、无药物）以及空白组（仅有培养基），每组6个复孔，继续培养24 h后，弃去培养液，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），继续孵育4 h后，每孔加入150 μL DMSO，振荡摇匀10 min，于570 nm处检测各组的吸光度（）值，计算细胞的增殖抑制率和半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）。实验重复3次。

细胞增殖抑制率＝1－(给药－空白)/(阴性对照－空白)

2.2.2 ELISA检测MH7A细胞上清液中炎症因子含量 取对数生长期的MH7A细胞，以5×104个/mL接种在24孔板上，每孔500 µL，待24 h细胞贴壁，分别加入含有入山虎氯仿、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位、MTX的培养基（质量浓度分别为IC50的1/2、1/4、1/8），空白组、模型组加入等体积的完全培养基，再加入TNF-α（终质量浓度为20 ng/mL），干预24 h，收集细胞上清液，于−20 ℃保存备用。按照试剂盒说明书测定上清液中IL-6、IL-17A和IL-1β的含量。

2.3 入山虎不同提取部位的体内抗RA活性研究

2.3.1 动物模型的构建、分组与给药 按照参考文献方法[15-17]，取96只SD雄性大鼠，适应性饲养7 d后，随机分成空白组、模型组、MTX（0.5 mg/kg，2次/周）组、氯仿部位（6 g/kg，1次/d）组、石油醚部位（6 g/kg，1次/d）组、醋酸乙酯部位（6 g/kg，1次/d）组、正丁醇部位（6 g/kg，1次/d）组、水部位（6 g/kg，1次/d）组。除空白组，其余组大鼠右后足趾部皮内注射完全弗氏佐剂0.2 mL致炎。造模成功后，空白组和模型组ig 0.5% CMC-Na水溶液，其余组连续22 d ig相应药物。

2.3.2 观测指标

（1）体质量变化：每4天测定每只大鼠的体质量，并记录。

（2）全身评分：造模成功后观察并记录各组大鼠后足关节病变程度，每4天进行1次全身评分，每只大鼠评分为0～8分，评分标准见表1。

（3）关节炎指数测定：造模成功后观察并记录各组大鼠后足关节病变程度，每4天进行1次关节炎评分。每只大鼠的关节炎指数评分为单只大鼠后足关节炎评分乘以4，评分标准见表2。

（4）RA大鼠足趾肿胀度测定：用游标卡尺测量全部大鼠右后足厚度，分别在注射佐剂前及造模成功后每4天进行测量，计算肿胀度。

肿胀度＝造模后足跖厚度－造模前足跖厚度

（5）脏器系数的测定：末次ig给药后24 h，ip 20%乌拉坦溶液，随后颈椎脱臼处死大鼠，快速取出大鼠的脏器，称定质量，并计算脏器指数。

脏器指数＝脏器质量/体质量

表1 全身评分项目及标准

表2 关节炎指数评分标准

（6）组织病理学观察：颈椎脱臼处死大鼠后，分离右足踝关节部位，脱水，石蜡包埋，切片，进行苏木素-伊红（HE）染色，于显微镜下观察并拍照。

（7）ELISA法检测RA大鼠血清中炎症因子含量：大鼠ip 20%乌拉坦（1 g/kg），随后颈椎脱臼处死大鼠，腹主动脉取血，4 ℃、3000 r/min离心10 min，分离血清，按照ELISA试剂盒说明书测定血清中IL-1β、IL-17A、IL-6、IL-4、IL-10含量。

2.4 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析入山虎提取物的化学成分

考虑到石油醚提取物大多数是低极性成分，主要为长链脂肪烃等成分，活性成分可能较少；水提取物大多是极性大的维生素、氨基酸等成分，活性成分可能也较少，同时因正丁醇、醋酸乙酯、氯仿提取物在体内外具有良好的抗RA活性，且极性中等，因此选择正丁醇、醋酸乙酯、氯仿的提取物进行定性分析。

2.4.1 待测样品的处理 取入山虎正丁醇、醋酸乙酯、氯仿提取物的浸膏1.0 g，加入20 mL甲醇溶解，取1 mL加甲醇定容到10 mL，用0.22 µm滤膜过滤后进样分析。两面针碱、二氢白屈菜红碱、盐酸白屈菜红碱、盐酸血根碱、花椒碱、毛两面针素、白鲜碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、木兰花碱、茵芋碱、盐酸四氢巴马汀、飞龙掌血素、去甲乌药碱对照品均用甲醇配成100 µg/mL对照品储备液，取对照品储备液用甲醇稀释制成10 µg/mL混合对照品溶液，即可。

2.4.2 色谱和质谱条件 Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 µm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～25 min，98%～55% A；25～32 min，55%～10% A；32～32.1 min，10%～98% A；32.1～35 min，98% A；体积流量0.3 mL/min；进样量1.0 µL；柱温40 ℃。

质谱分析采用Waters电喷雾离子源的四极杆飞行时间质谱分析仪。正离子源碰撞电压分别为3 kV；离子源温度100 ℃；脱溶剂温度350 ℃；样品锥孔电压40 kV；萃取锥孔电压4 kV；锥孔气体积流量50 L/h；溶媒挥散体积流量600 L/h；扫描范围/100～1200；低碰撞能量10 eV；高碰撞能量30 eV。采用MSE Continuum扫描模式（非数据依赖扫描模式）对化合物进行鉴定。液质系统、数据采集、定量处理由Masslynx 4.1软件控制。

2.4.3 化合物定性 通过UPLC-Q-TOF-MS/MS平台采集得到原始数据，采用Progenesis QI软件对原始数据进行导入、峰对齐、峰提取、归一化处理，最终形成保留时间、质荷比和峰强度的化合物库，通过加氢和加钠等均去卷积到每个离子特征。对一级质谱数据分析得到可能的分子式和候选化合物，通过二级质谱碎片，结合对照品的裂解规律及相关裂解途径，文献资料、质谱数据库推导可能的骨架结构，及已报道的同科同属两面针化学成分相关研究推导最终的分子结构。

2.4.4 入山虎不同提取物化学成分差异分析 将入山虎不同提取物（每个提取物重复6个样品）中的峰面积数据进行收集，以质谱离子流图中峰的响应强度值作为相对定量的原数据。帕莱托换算（Paerto Scaling）是代谢组学中常用的换算方法，本研究采用帕莱托换算对原数据进行数据标度换算，将定量数据提交在线软件Metaboanalyst 5.0进行聚类分析并绘制热图，以直观分析入山虎不同提取物间化学成分的含量差异。

2.5 高效液相法测定化合物含量

2.5.1 色谱条件 Welch Ultimate XB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），以乙腈（A）-水（B）溶液（含0.2%甲酸、0.25%三乙胺）为流动相进行梯度洗脱：0～5 min，15% A；5～10 min，15%～20% A；10～25 min，20%～35% A；25～35 min，35%～60% A；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 µL；检测波长271 nm。

2.5.2 混合对照品的制备 精密称取木兰花碱、橙皮苷、两面针碱对照品适量，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色量瓶中，制成质量浓度分别为0.816 0、0.898 0、0.202 0 mg/mL的混合对照品溶液。并稀释得到木兰花碱的质量浓度分别为0.816 0、0.326 4、0.130 6、0.052 2、0.020 9 mg/mL，橙皮苷的质量浓度分别为0.898 0、0.143 7、0.057 5、0.023 0、0.009 2 mg/mL，两面针碱的质量浓度分别为0.202 0、0.080 8、0.032 3、0.012 9、0.005 2 mg/mL的一系列混合对照品溶液，按上述色谱条件进样分析。

2.5.3 供试品溶液的制备 取入山虎水部位提取物约l g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL超声溶解，用0.22 µm微孔滤膜滤过，按上述色谱条件进样分析。

3 结果

3.1 入山虎不同提取部位的体外抗RA活性

3.1.1 入山虎不同提取部位对MH7A细胞增殖的影响 如图1所示，入山虎的不同提取部位对MH7A细胞均有抑制增殖的作用，氯仿、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位的IC50分别为（6.421 8±0.479 3）、（2.252 0±0.357 8）、（6.886 2±0.177 3）、（1.307 0±0.098 1）、（5.479 7±0.393 7）mg/mL，IC50从大到小依次为醋酸乙酯、氯仿、水、石油醚、正丁醇部位。因入山虎不同提取部位IC50的1/2、1/4、1/8在一定质量浓度范围内随给药浓度的增加，细胞增殖率下降越明显，后续选择IC50的1/2、1/4、1/8进行实验。

与空白组（0 mg·mL−1）比较：*P＜0.05 **P＜0.01

3.1.2 入山虎不同提取部位对MH7A细胞上清液中炎症因子含量的影响 如图2所示，在炎症因子TNF-α的刺激下，与空白组比较，模型组IL-6、IL-17A、IL-1β含量显著升高（＜0.01）；用入山虎不同提取部位干预后，与模型组比较，不同质量浓度的氯仿及石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位组IL-6、IL-17A、IL-1β含量均显著减少（＜0.01）。

3.2 入山虎不同提取部位的体内抗RA作用

3.2.1 入山虎不同提取部位对RA大鼠体质量的影响 如图3所示，模型组以及入山虎不同提取部位组的大鼠体质量均低于空白组（＜0.05、0.01），但入山虎各组大鼠体质量均呈现增长的趋势，大鼠体质量也比较接近，提示入山虎不同提取部位对RA大鼠的体质量增长有一定的促进作用。

与空白组比较：##P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01；L、M、H分别代表低、中、高剂量组，分别为IC50的1/8、1/4、1/2

与空白组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下图同

3.2.2 入山虎不同提取部位对RA大鼠全身评分的影响 MTX组、石油醚组在6 d后全身评分均明显低于模型组（＜0.05、0.01），氯仿组大鼠在10 d后全身评分均显著低于模型组（＜0.01），在18～22 d，入山虎不同提取部位组的大鼠全身评分均低于模型组（＜0.05、0.01），全身评分的分数由低到高依次为氯仿组、石油醚、醋酸乙酯、水部位、正丁醇组，见图3。

3.2.3 入山虎不同提取部位对RA大鼠关节炎指数的影响 与模型组比较，MTX组在6 d后大鼠的关节炎评分显著降低（＜0.01），氯仿组在10 d后大鼠的关节炎评分显著降低（＜0.01），石油醚组、醋酸乙酯组、正丁醇组在18 d后，能够缓解RA大鼠的关节炎症状，明显降低了大鼠的关节炎评分（＜0.05、0.01）。水部位组的RA大鼠关节炎症状在22 d也有改善（＜0.05）。关节炎指数评分由低到高依次为氯仿组、石油醚组、正丁醇组、醋酸乙酯组、水部位组，见图3。

3.2.4 入山虎不同提取部位对RA大鼠足趾肿胀度的影响 采用完全弗氏佐剂在右后足趾皮内注射造模后，右后足趾开始逐渐变红、肿胀明显，在造模3、4 d左右达到峰值，脚趾关节间及前足趾出现关节肿大，触及关节大鼠呈现疼痛反射，后肢伸屈不利，睡眠时右足趾不着地。在6 d后MTX组、氯仿组、石油醚组的RA大鼠肿胀度均明显小于模型组（＜0.01）。在14 d后，醋酸乙酯组、正丁醇组的RA大鼠的肿胀度显著低于模型组（＜0.05、0.01），而水部位组的RA大鼠在22 d后其右足肿胀度也有所改善，且低于模型组（＜0.05）。足跖肿胀度由低到高依次为石油醚组、氯仿组、正丁醇组、水部位组、醋酸乙酯组，见图3。

3.2.5 入山虎不同部位对RA大鼠脏器指数的影响 如图4所示，与空白组比较，模型组的脾脏指数和肝脏指数显著增高（＜0.01），表现出一定的免疫亢进。与模型组比较，氯仿、石油醚、正丁醇、水提取部位组和MTX组均能够降低RA大鼠的脾脏、肝脏指数（＜0.05、0.01）。醋酸乙酯组也具有降低RA大鼠的脾脏指数和肝脏指数的趋势，但无显著性差异。

3.2.6 入山虎不同部位对RA大鼠踝关节病理的影响 如图5所示，空白组大鼠关节软骨平整，关节腔内干净，滑膜细胞及结缔组织未见增生，未见明显异常。模型组大鼠踝关节结缔组织增生、可见被结缔组织包裹的巨噬细胞团，局部关节软骨损伤、可见一定量的结缔组织增生，大量的炎性细胞浸润，滑膜增生。ig入山虎不同提取物后，上述病理改变均得到不同程度的改善，尤其以氯仿组效果最为明显。表明入山虎不同提取物具有良好的改善RA模型大鼠踝关节组织病变的作用，即具有较好的抗RA作用。

图4 入山虎不同提取部位对RA大鼠脾脏和肝脏指数的影响(, n = 12)

图5 入山虎不同提取部位对RA大鼠踝关节(A) 及滑膜组织(B) 病理变化的影响(HE, ×100)

3.2.7 入山虎不同提取部位对RA大鼠血清中致炎因子IL-1β、IL-6和IL-17A水平的影响 如图6所示，与空白组比较，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-17A的含量明显提高（＜0.01）；与模型组比较，MTX组以及入山虎的不同提取部位组能够减少RA大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-17A的含量（＜0.01）。

3.2.8 入山虎不同提取部位对RA大鼠血清中抗炎因子IL-4和IL-10水平的影响 如图7所示，与空白组比较，模型组大鼠血清中IL-4、IL-10的含量明显降低（＜0.01）；与模型组比较，入山虎提取部位中氯仿组以及MTX组的IL-4的含量均显著升高（＜0.01），石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位组的IL-4的含量也有升高，但是差异不具有统计学意义。入山虎的不同提取部位组均能够升高RA大鼠血清中的IL-10的含量（＜0.01）。其中，氯仿组IL-4、IL-10的含量与MTX组相当。

图6 入山虎不同提取部位对RA大鼠血清中IL-1β、IL-6和IL-17A水平的影响(, n = 12)

图7 入山虎不同提取部位对RA大鼠血清中IL-4和IL-10水平的影响(, n = 12)

3.3 入山虎提取部位的化学成分分析

参考两面针药材化学成分分析相关文献报道[36]，本实验选择正离子模式进行分析，得到混合对照品及提取物的一级质谱基峰图，见图8。结合对照品图谱中的保留时间、准分子离子、二级碎片离子信息、裂解规律，以及相关文献报道[37-56]，最终初步筛选得到入山虎化合物69个，初步鉴定结构55个，未知14个。鉴定结果见表3，入山虎提取的化学成分比较相近，主要以生物碱类的成分居多，包括呋喃喹啉类、苄基异喹啉类、原小檗碱类、阿朴啡类、苯并菲啶类、酰胺类等生物碱以及黄酮、香豆素等其他化合物。

3.4 入山虎不同提取物化学成分差异分析结果

聚类热图（图9）显示，入山虎不同提取物的化学成分含量具有显著差异，而不同提取物的重复样品内的化学成分含量相似。结果显示，68个化合物可以明显地聚类成2个大类群。同时每个大类群又聚类成2个亚群。来自于大类群I中的2个亚群的化合物在醋酸乙酯提取物组的含量显著高于氯仿和正丁醇组，氯仿组最低，同时2个亚群的代谢物又存在一定差异，即醋酸乙酯提取物中coptisine（52）、rutaecarpine（54）、去-甲基白屈莱红碱（62）、二氢白屈菜红碱（64）等的含量相对较高。而来自大类群II中亚群3的化合物在正丁醇提取物组中的含量显著高于氯仿和醋酸乙酯组，正丁醇提取物中的橙皮苷（23）、四氢巴马汀（24）、药根碱（26）等的含量相对较高。而亚群4的化合物在氯仿提取物组的含量显著高于正丁醇和醋酸乙酯组，亚群5的化合物在醋酸乙酯提取物组的含量显著低于氯仿和正丁醇组，氯仿提取物中的去甲乌药碱（1）、小檗红碱（25）、两面针碱（39）、茵芋碱（43）、白藓碱（46）、木兰花碱（8）等的含量相对较高。

A、B、C依次为正丁醇、醋酸乙酯、氯仿提取部位，D为混合对照品

表3 入山虎提取物的化学成分UPLC-Q-TOF-MS/MS鉴别结果

续表3

续表3

▲代表经过对照品比对，△参考文献、数据库数据，无标记表示无文献参考

▲represents that after comparison of reference substances,△references literature and database data, unmarked means no literature reference

A、B、C依次为氯仿、醋酸乙酯、正丁醇提取部位

3.5 入山虎化合物定量结果

由“3.4”项下入山虎不同提取物的化学成分差异分析结果可知，木兰花碱、橙皮苷、两面针碱在入山虎提取物中的含量相对较高，在高效液相色谱仪中也能够鉴定这个3个成分，因此，选择木兰花碱、橙皮苷、两面针碱进行定量测定。

3.5.1 方法学考察结果

（1）线性考察：将混合对照品按“2.5.1”项下的色谱条件进样测定，记录木兰花碱、橙皮苷、两面针碱的峰面积。以质量浓度为横坐标（）、以峰面积为纵坐标（）进行线性回归，得到木兰花碱、橙皮苷、两面针碱的回归方程分别为＝8 006.3＋178 659，2＝0.999 1；＝9 377.9－151 624，2＝0.999 1；＝50 224－55 478，2＝0.999 9。结果表明，3种成分在相应的质量浓度范围内与峰面积的线性关系良好。

（2）精密度考察：将入山虎供试品溶液按“2.5.1”项下色谱条件连续进样6次，计算木兰花碱、橙皮苷、两面针碱峰面积的RSD分别为0.43%、0.62%、1.57%，表明仪器精密度良好。

（3）稳定性考察：分别在0、2、4、8、12、24 h将入山虎供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进样，计算木兰花碱、橙皮苷、两面针碱峰面积的RSD分别为1.86%、0.91%、1.33%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

（4）重复性考察：平行制备6份供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱方法进样，计算木兰花碱、橙皮苷、两面针碱的质量分数RSD分别为2.39%、2.07%、2.62%，表明该方法重复性良好。

（5）加样回收率考察：取入山虎供试品溶液6份，每份约0.5 g，精密称定，并精密加入等量的木兰花碱、橙皮苷、两面针碱对照品，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，计算木兰花碱、橙皮苷、两面针碱的峰面积，木兰花碱、橙皮苷、两面针碱加样回收率为95.00%～105.00%，RSD分别为2.23%、1.86%、2.16%，表明该方法的准确度良好。

3.5.2 定量结果 将混合对照品和供试品溶液按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，计算木兰花碱、橙皮苷、两面针碱的峰面积，HPLC图谱见图10。以质量浓度为横坐标（）、峰面积为纵坐标（）进行线性回归，得到木兰花碱、橙皮苷、两面针碱的回归方程分别为＝8 006.3＋178 659，2＝0.999 1；＝9 377.9－151 624，2＝0.999 1；＝50 224－55 478，2＝0.999 9。根据回归方程计算得到木兰花碱、橙皮苷、两面针碱的质量分数分别为（2.992 0±0.024 0）、（4.253 2±0.045 9）、（0.965 8±0.001 1）mg/g。橙皮苷含量较高，木兰花碱、两面针碱次之。

1-木兰花碱 2-橙皮苷 3-两面针碱

4 讨论

研究表明，抑制RA成纤维样滑膜细胞的增生和炎性反应能够缓解RA的疼痛，同时，有效抑制炎症因子的分泌对RA治疗也具有重要意义[18-19]。而MH7A滑膜纤维细胞是从RA患者的关节滑膜处提取得到，具有类似人RA成纤维样滑膜细胞的特点[20]，增殖速度较快，可多次传代，可代替人RA成纤维样滑膜细胞用于RA的研究。因此，本研究采用入山虎的不同提取部位对MH7A细胞进行干预，考察其增殖活性和炎症因子的含量。结果显示，入山虎的氯仿、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水提取部位组均能够有效抑制MH7A细胞的增殖，从增殖抑制率上看，正丁醇部位的抑制率较好，氯仿、石油醚、水部位的效果比较接近，水部位次之。

采用TNF-α诱导MH7A细胞后，模型组炎症因子IL-6、IL-17A、IL-1β含量增加，与文献报道一致，在炎症因子刺激下，滑膜成纤维细胞可以分泌其他相关的炎症因子，如IL-1β、IL-17等[21-25]。还有研究表明，作为致炎因子的IL-1β能够在RA滑膜组织中大量表达，同时还会诱导其他相关炎症因子的表达，加重RA的炎症反应[26-27]。IL-6、IL-17A等炎症因子能够促进RA滑膜细胞的增殖、迁移和侵袭，甚至诱导关节软骨侵蚀[28-30]。在本研究中，入山虎不同提取部位可有效降低TNF-α诱导MH7A细胞分泌的炎症因子IL-6、IL-17A、IL-1β的含量。

足肿胀程度和关节病理变化是评价抗RA药物疗效的重要指标[31-33]。本研究参照文献[15-17]中的造模方法，在大鼠的足跖部注射完全弗氏佐剂建立大鼠RA动物模型，造模后大鼠的全身评分≥4、关节炎指数评分≥16，出现前足或后足关节红肿、踝关节明显肿胀，严重者还会出现拖行现象，与文献[34-35]报道一致，视为造模成功。因此，本次研究中已成功造模，模型组大鼠的足跖肿胀度及全身评分、关节炎指数显著升高，且HE染色结果可以看出模型组结缔组织增生，有大量的炎性细胞浸润等现象，而ig给予入山虎的不同提取部位后，均可在不同程度上降低完全弗氏佐剂诱导的RA大鼠的足跖肿胀度、全身评分及关节炎评分，能改善大鼠踝关节组织的病理改变、降低脏器指数。对RA大鼠血清中的炎症因子进行测定，结果也提示入山虎的不同提取部位具有良好的抗RA作用，均能够减少炎症因子IL-6、IL-17A、IL-1β的含量，升高抗炎因子IL-10的含量。其中，在体内实验中的全身评分、关节炎指数评价中，以氯仿部位的效果相对较好，在RA大鼠血清的抗炎因子IL-10结果中，以氯仿部位的效果相对较好，同时氯仿部位还能升高抗炎因子IL-4的含量。而在体外实验中，入山虎不同提取物的炎症因子水平各组间结果相近，无统计学差异，以上结果提示氯仿部位可能是入山虎的抗RA的主要活性部位。

入山虎的化学成分、质量标志物相关研究报道比较少，在一定程度上制约了入山虎的临床应用与实验研究。本研究采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技术对入山虎的正丁醇、醋酸乙酯、氯仿提取物进行化学成分分析，筛选得到化合物69个，初步鉴定结构55个，未知14个。结果可见，入山虎的提取物主要含有生物碱类成分，主要包括呋喃喹啉类、苄基异喹啉类、原小檗碱类、阿朴啡类、苯并菲啶类、酰胺类等生物碱，同时还含有黄酮类、香豆素等其他化合物。本研究未对入山虎总提取物进行抗RA活性研究，而化学成分鉴定可知，入山虎不同提取物均具有结构多样化的生物碱类成分，这些生物碱类成分可能是入山虎抗RA的活性成分。因此，其总提取物应具有更广泛的生物碱类成分，更具有一定的抗RA活性作用。而体内外实验结果提示，入山虎的氯仿部位可能是入山虎抗RA的活性部位，而在化学成分差异分析中，氯仿提取物中的去甲乌药碱、小檗红碱、两面针碱、茵芋碱、白藓碱、木兰花碱等一类亚群化合物的含量相对于醋酸乙酯组、正丁醇组较高，与其他2组具有一定的差异，推测这一类亚群的成分可能是导致不同提取物抗RA作用的差异成分。因此，后续应需要继续对氯仿部位分离、纯化、鉴定，进一步研究入山虎抗RA的活性成分。同时本研究还对入山虎的两面针碱、木兰花碱、橙皮苷进行定量，可为后续入山虎质量标准的研究提供参考。

综上，入山虎中的氯仿、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水部位在体内外对RA均具有良好的抗炎作用，在体外能够抑制MH7A细胞的增殖，减少炎症因子IL-6、IL-17A、IL-1β的分泌；在体内对RA大鼠有良好的抗炎作用，还能减少促炎因子IL-6、IL-17A、IL-1β的分泌，增加抗炎因子IL-4、IL-10的分泌，综合来看以氯仿部位的效果较优，且入山虎的提取部位主要含有生物碱类成分。本研究可为入山虎治疗RA的药效物质基础提供一定的依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Anti-rheumatoid arthritis activity of different extracts fromvar.

ZENG Ying-gang1, WANG Liu-ping1, 2, 3, FENG Jian-fang1, 2, 3, TANG Dan-dan1, MENG Gan-zhu1

1. Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 2. Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 3. Guangxi Superior Chinese Patent Medicine and National Medicine Development Engineering Technology Research Center, Nanning 530020, China

To investigate the effect of different extraction parts fromvar.(ZN) on rheumatoid arthritis (RA) and chemical composition analysis of extraction parts.The human RA fibroblast-like synoviocyte cell line MH7A cells were used to investigate the effects of different extraction parts of ZN on the proliferation activity and contents of inflammatory factors. RA rat model was established by intradermal injection of Freund’s complete adjuvant into the toes of rats. The body weight, whole body score, arthritis score, degree of swelling, organ coefficient and contents of inflammatory factor of rats were measured, pathology of ankle joint tissue was used by HE staining to evaluate the anti-RA activity of different extraction parts of ZN. And the chemical constituents of the extract were analyzed by UPLC-Q-TOF-MS/MS.Chloroform, petroleum ether, ethyl acetate,-butanol and water extraction parts of ZN had good anti-inflammatory effects on RAand. ZN could inhibit the proliferation of MH7A cells(< 0.05, 0.01), reduce the secretion of inflammatory factors interleukin-6 (IL-6), IL-17A and IL-1β (< 0.01)., the extraction parts of ZN could reduce the paw swelling, whole body score and arthritis score of RA rats to varying degrees (< 0.05, 0.01), improve the pathological changes of ankle joint, alleviate the inflammatory symptoms of RA rats, reduce the secretion of pro-inflammatory factors IL-6, IL-17A and IL-1β (< 0.01), increase the secretion of anti-inflammatory factors IL-4 and IL-10 (< 0.01). The chemical constituent analysis showed that the extracts of ZN contained similar compounds, including alkaloids, flavonoids, coumarins and other compounds. Most of them were alkaloids, including furan quinolines, benzylisoquinolines, protoberberines, aporphines, benzophenanthridines, amides and so on.Chloroform, petroleum ether, ethyl acetate,-butanol and water extraction parts of ZN have good anti-inflammatory effects on RAand. The extract mainly contains alkaloids, flavonoids, coumarins and other compounds.

(Roxb.) DC. var.Huang;different extraction parts; rheumatoid arthritis; inflammatory factors; alkaloids; flavonoids; coumarins; magnoflorine; hesperidin; nitidine

R285.5

A

0253 - 2670(2023)13 - 4186 - 16

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.012

2023-02-08

国家重点研发计划项目（2019YFC1712304）；广西科技基地和人才专项（桂科AD20238058）；广西壮瑶药重点实验室项目（GXZYKF2022-16）；广西中医药管理局科研课题（GXZYZ20210068）

曾英港（1997—），女，壮族，硕士研究生，研究方向为中药药剂。Tel: 14777264959 E-mail: zengyinggang2016@163.com

通信作者：王柳萍（1978—），女，壮族，博士，教授，硕士生导师，研究方向为中药、民族药的品质与药效研究。Tel: 18607713396 E-mail: rousel@126.com

奉建芳（1966—），男，瑶族，博士，教授，博士生导师，研究方向为中药、民族药制剂研究。Tel: 13817588549 E-mail: fengjianfang@vip.163.com

[责任编辑 李亚楠]