TPGS表面修饰岩白菜素固体脂质纳米粒的制备与口服生物利用度研究

杨金枝，崔晓鸽，郝海军

TPGS表面修饰岩白菜素固体脂质纳米粒的制备与口服生物利用度研究

杨金枝1，崔晓鸽1，郝海军2, 3*

1. 郑州澍青医学高等专科学校，河南 郑州 450064 2. 上海市中药研究所，上海 201401 3. 上海雷允上药业有限公司，上海 201401

制备-α-维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS）修饰岩白菜素固体脂质纳米粒（TPGS surface-modified bergenin solid lipid nanoparticles，TPGS-Ber-SLN），并考察其体外释药和口服药动学行为。采用高压均质法制备TPGS-Ber-SLN。以包封率、载药量和粒径为考察指标，通过单因素考察结合Box-Behnken设计-效应面法（Box Behnken design- response surface methodology，BBD-RSM）优化TPGS-Ber-SLN处方，并制备成冻干粉末。X射线粉末衍射法（X-ray powder diffraction，XRPD）和差式扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）分析岩白菜素在TPGS-Ber-SLN冻干粉末中的存在状态，透析袋法考察TPGS-Ber-SLN在不同介质中释药情况。以岩白菜素原料药为参考，比较TPGS-Ber-SLN在体内药动学行为及口服生物利用度。TPGS-Ber-SLN最佳处方工艺：岩白菜素用量为40 mg，单硬脂酸甘油酯用量525 mg，泊洛沙姆188质量浓度为17.5 mg/mL，TPGS质量浓度为0.2 mg/mL，均质次数为9次。TPGS-Ber-SLN的平均包封率、载药量、粒径及ζ电位分别为（83.16±1.09）%、（4.97±0.13）%、（229.46±19.07）nm和（−15.67±0.23）mV，体外释药过程符合Weibull模型。口服药动学结果显示，TPGS-Ber-SLN的max延长至（2.07±0.43）h，1/2延长至（4.21±0.78）h，max和生物利用度分别提高至3.91倍和5.34倍。TPGS-Ber-SLN显著改变了岩白菜素的药动学行为，增加了口服吸收生物利用度。

岩白菜素；固体脂质纳米粒；-α-维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯；药动学；口服生物利用度

岩白菜素（bergenin，Ber）是一类异香豆素类化合物，主要存在于虎耳草科、豆科、紫金牛科等植物中[1]，国内外研究显示，岩白菜素具有抗肿瘤、消炎、镇痛、增强免疫、抗糖尿病、肾脏保护、镇咳等活性[1-2]，且毒性很小[1]，具备开发成新药的潜力。岩白菜素属于生物药剂学IV类药物[3]，在25 ℃下溶解度为（1.37±0.02）mg/mL[4]，表观油/水分配系数lg为−1.060±0.033～−1.190±0.044[3]。据报道[4-5]，岩白菜素在酸性和中性条件下可保持稳定，但在碱性条件下可发生降解现象，降解速度随着pH值增加而加快[5]，且受P-糖蛋白外排作用影响[6]导致岩白菜素口服生物利用度仅为4.83%[5]。目前岩白菜素已有固体分散体[7]、磷脂复合物[3]、自微乳[8]等制剂新技术报道。但固体分散体并不能改善岩白菜素的透膜能力及P-糖蛋白外排作用等；磷脂复合物在胃肠道中容易发生解离[9]，可能会削弱促吸收作用；自微乳技术需要添加大量的表面活性剂，存在一定的安全隐患。

固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）是由可生物降解、安全性高的固态脂质作为载体制备的一种纳米给药系统，具有提高药物在胃肠道的稳定性、促进药物体内吸收、提高生物利用度、增强药效等优势[10-11]，且SLN的稳定性优于脂质体[12]。-α-维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯（-α- tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate，TPGS）是一种非离子型表面活性剂，不仅有助于增加药物的溶解度、提高纳米制剂的包封率，而且可抑制P-糖蛋白活性[13-14]，从而有利于增加药物口服吸收[15-17]。故本研究将岩白菜素制备成TPGS表面修饰固体脂质纳米粒（TPGS surface-modified bergenin solid lipid nanoparticles，TPGS-Ber-SLN），以包封率、载药量、粒径为指标，通过单因素试验结合Box-Behnken设计-效应面法（Box Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）优化TPGS-Ber-SLN处方工艺，为便于储存及给药故将TPGS-Ber-SLN制备成冻干粉，并考察TPGS- Ber-SLN冻干粉体外释药及体内药动学行为，为后续药效学评价奠定实验基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BSA124S型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；1100型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；HJ-3型磁力搅拌器，常州市伟嘉仪器制造有限公司；RCY-1400T型智能溶出仪，博科控股集团有限公司；RE-200型旋转蒸发仪，华辰仪器有限公司；KL-060型超声波仪器，深圳市科力超声波洗净设备有限公司；CGJB60-70型实验室用高压均质机，郑州玉祥机械设备有限公司；XLW型超低温冰箱，江苏天日智能科技有限公司；LGJ-10N型真空冻干机，北京亚星仪科科技发展有限公司；Topsizer型激光粒度分析仪，珠海欧美克仪器有限公司；JEM-2100 透射电子显微镜（TEM），日本电子株式会社；HS-50AA型恒温恒湿箱，上海目尼实验设备有限公司；D8 Venture型X射线粉末衍射仪，德国布鲁克仪器公司；DSC-HSC-2型差示扫描量热仪，北京恒久实验设备有限公司；ZX-DC型氮吹仪，北京众信佳仪科技有限公司。

1.2 试剂

岩白菜素对照品，批号JW10533，质量分数98.6%，上海极威生物科技有限公司；岩白菜素原料药，批号191208，质量分数98.0%，湖北新星化工有限公司；对乙酰氨基酚对照品，批号100018- 210615，质量分数99.4%，中国食品药品检定研究院；磷酸（批号C12747030）、四氢呋喃（批号C10303495），上海麦克林生化科技有限公司；单硬脂酸甘油酯（批号F1821057）、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS，批号T124208），阿拉丁试剂（上海）有限公司；无水乙醇（批号20200921）、醋酸乙酯（批号20200322），国药集团化学试剂有限公司；大豆磷脂，批号200718，上海辅必成医药科技有限公司；泊洛沙姆188（批号WPEE587E，德国巴斯夫有限公司）；乳糖（批号191220）、甘露醇（批号201028），郑州宇控生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 动物

SD大鼠，体质量（220±20）g，雌雄兼具，购自河南动物实验中心［许可证号SCXK（豫）2020- 0001］，每组实验中雌雄数量各半。饲养温度为20～25 ℃，相对湿度为50%～65%，实验室适应1周后进行药动学研究，给药前禁食12 h，自由饮水。遵循郑州澍青医学高等专科学校有关实验动物管理和使用的规定，均符合3R原则。

2 方法与结果

2.1 TPGS-Ber-SLN的制备[15,17]

精密称取40 mg岩白菜素和100 mg大豆磷脂至圆底烧瓶，加入10 mL四氢呋喃并置于75 ℃水浴中磁力搅拌1 h（800 r/min）至澄清，减压旋蒸除去四氢呋喃[4]，加入处方量的固态脂质和10 mL无水乙醇并置于75 ℃水浴中，磁力搅拌（800 r/min）约10 min至体系澄清即得有机相。配制含一定质量浓度的泊洛沙姆188及TPGS的水相，水相体积为50 mL，置于75 ℃水浴中磁力搅拌溶解。将有机相缓慢加至水相，继续磁力搅拌20 min（800 r/min），于一定均质压力下均质数次，置于−10 ℃冰箱中存放15 min，过0.45 μm微孔滤膜，补加蒸馏水至50 mL，即得TPGS-Ber-SLN混悬液。

2.2 TPGS-Ber-SLN中岩白菜素含量测定

2.2.1 色谱条件[6]色谱柱为Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 µm）；检测波长为275 nm；柱温为30 ℃；流动相为甲醇-水（20∶80，稀磷酸调节pH值至2.5）；体积流量为1.0 mL/min；进样体积为10 µL。理论塔板数以岩白菜素计不低于6000。

2.2.2 TPGS-Ber-SLN供试品溶液的配制 精密量取1 mL的TPGS-Ber-SLN混悬液至50 mL量瓶中，加入约30 mL甲醇超声5 min（超声功率为250 W、频率为40 kHz），加入甲醇稀释，混匀后过0.45 μm微孔滤膜。精密量取5 mL至10 mL量瓶中，加入流动相稀释，即得TPGS-Ber-SLN供试品溶液。

2.2.3 岩白菜素对照品溶液的配制 精密称取岩白菜素对照品20 mg至100 mL量瓶中，加入约80 mL甲醇超声溶解（超声功率为250 W、频率为40 kHz），加入甲醇稀释至刻度，即得岩白菜素对照品储备液（质量浓度为200 μg/mL）。

2.2.4 线性关系考察 分别精密量取质量浓度为200 μg/mL的岩白菜素对照品储备液，加入流动相配制成质量浓度为10.00、5.00、2.50、1.00、0.50、0.05 μg/mL的系列对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，以岩白菜素峰面积为纵坐标（），质量浓度为横坐标（），得回归方程为＝17.666 2－0.045 8，＝0.999 9，结果表明岩白菜素在0.05～10.00 μg/mL线性关系良好。

2.2.5 专属性考察 取空白辅料制备阴性样品，另取岩白菜素对照品溶液和TPGS-Ber-SLN供试品溶液分别进样测定，结果见图1，试验结果表明辅料未对岩白菜素色谱峰产生干扰，专属性高。

图1 空白辅料(A)、岩白菜素对照品(B)和TPGS-Ber-SLN样品(C)溶液的HPLC图

2.2.6 精密度考察 取0.05、2.50、10.00 μg/mL对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别连续进样测定6次，计算得岩白菜素峰面积的RSD分别为0.68%、0.12%、0.16%，结果表明仪器精密度良好。

2.2.7 重复性考察 取1份TPGS-Ber-SLN混悬液，按“2.2.2”项下方法平行制备6份TPGS-Ber-SLN供试品溶液并进样测定，按“2.2.1”项下色谱条件分别进样测定，计算得岩白菜素质量浓度的RSD为0.89%，结果表明该方法的重复性良好。

2.2.8 稳定性考察 取TPGS-Ber-SLN供试品溶液，置于室温（温度25 ℃，湿度55%），分别于制备后0、2、4、8、12、24 h取样，按“2.2.1”项下色谱条件分别进样测定，计算得岩白菜素峰面积的RSD为1.45%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.9 加样回收率考察 精密量取0.5 mL的TPGS-Ber-SLN混悬液置于50 mL量瓶中，平行9份，分为低、中、高3组，分别加入岩白菜素对照品储备液（质量浓度为200 μg/mL）1、2、3 mL，按照“2.2.2”项下方法分别制备TPGS-Ber-SLN的供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定岩白菜素含量，计算得岩白菜素的平均加样回收率为101.54%，RSD为1.58%。

2.3 TPGS-Ber-SLN包封率及载药量的测定

精密量取TPGS-Ber-SLN混悬液1 mL至超滤管中（平均截留相对分子质量12 000），于4 ℃下12 500 r/min离心（离心半径为6.8 cm）20 min[18]，取续滤液，按“2.2.1”项下色谱条件测定游离岩白菜素的量（游离）。精密量取TPGS-Ber-SLN混悬液1 mL按“2.2.2”项下方法处理后按“2.2.1”项下色谱条件测定岩白菜素总量（总）。精密量取4 mL的TPGS-Ber-SLN混悬液于−50 ℃预冻1 d后置于低温冻干机中（−40 ℃）直接冻干，称定质量，计算1 mL的TPGS-Ber-SLN混悬液中药物与辅料总质量（总）。计算TPGS-Ber-SLN的包封率及载药量。

包封率＝(总－游离)/总

载药量＝(总－游离)/总

2.4 TPGS-Ber-SLN粒径及ζ电位的测定

精密量取TPGS-Ber-SLN混悬液0.1 mL，加入蒸馏水稀释40倍，摇匀。取4 mL置于四面透光型比色皿中测定TPGS-Ber-SLN粒径及多分散指数（polydispersity index，PDI）值。取稀释后的TPGS-Ber-SLN混悬液适量至ζ电位专用样品池中，测定ζ电位，平行测定3次，取平均值。

2.5 TPGS-Ber-SLN处方工艺研究

2.5.1 固态脂质种类的考察 岩白菜素投药量为40 mg，固态脂质用量为500 mg，泊洛沙姆188质量浓度为15.0 mg/mL，TPGS质量浓度为0.20 mg/mL，均质压力为80 MPa，均质次数为6次，考察固态脂质种类对TPGS-Ber-SLN的影响，结果见表1。结果显示，与双硬脂酸甘油酯和硬脂酸相比，单硬脂酸甘油酯制得的TPGS-Ber-SLN具有相对较高的包封率和载药量，平均粒径虽大于双硬脂酸甘油酯制得的TPGS-Ber-SLN，但两者之间无显著性差异（＝0.152 8＞0.05），因此，选择单硬脂酸甘油酯作为制备TPGS-Ber-SLN的固态脂质。

表1 固态脂质种类考察(, n = 3)

2.5.2 单硬脂酸甘油酯用量的考察 岩白菜素投药量为40 mg，单硬脂酸甘油酯为固态脂质，泊洛沙姆188质量浓度为15.0 mg/mL，TPGS质量浓度为0.20 mg/mL，均质压力为80 MPa，均质次数为6次，考察单硬脂酸甘油酯用量对TPGS-Ber-SLN的影响，结果见表2。结果显示，TPGS-Ber-SLN包封率随着单硬脂酸甘油酯用量增加而增加，可见加大载体用量利于提高包封率。但载药量随着单硬脂酸甘油酯用量的增加呈先增大后下降趋势，而粒径呈现先变小后增大趋势。为获得较高包封率和载药量、较小粒径的TPGS-Ber-SLN处方，选择单硬脂酸甘油酯用量在450～600 mg进行优化。

表2 单硬脂酸甘油酯用量的考察(, n = 3)

2.5.3 泊洛沙姆188质量浓度的考察 岩白菜素投药量为40 mg，单硬脂酸甘油酯用量为500 mg，TPGS质量浓度为0.20 mg/mL，均质压力为80 MPa，均质次数为6次，考察泊洛沙姆188质量浓度对TPGS-Ber-SLN的影响，结果见表3。结果显示，随着泊洛沙姆188质量浓度的增加TPGS-Ber-SLN包封率和载药量呈先增加后下降情况，所以适量增加泊洛沙姆188利于增加包封率及载药量，但泊洛沙姆188用量过大时可能由于增溶作用使药物进入水相[18]，导致包封率和载药量下降。TPGS-Ber-SLN粒径随着泊洛沙姆188质量浓度增加总体呈下降趋势，可见泊洛沙姆188质量浓度对TPGS-Ber-SLN影响较大，后续可对质量浓度12.5～22.5 mg/mL进行优化。

2.5.4 TPGS质量浓度的考察 岩白菜素投药量为40 mg，单硬脂酸甘油酯用量为500 mg，泊洛沙姆188质量浓度为15.0 mg/mL，均质压力为80 MPa，均质次数为6次，考察TPGS质量浓度对TPGS- Ber-SLN的影响，结果见表4。结果显示，当处方中不含TPGS时包封率及载药相对较低，随着TPGS质量浓度的增加TPGS-Ber-SLN包封率和载药量逐渐增加后下降，而粒径呈逐渐增加趋势。可能是由于TPGS长链有助于阻止TPGS-Ber-SLN表层或浅表层药物泄露[19]，从而使包封率和载药量增加；但TPGS用量过大时，TPGS长链之间的排斥作用降低了TPGS-Ber-SLN表面致密度，从而导致药物泄露。由于TPGS质量浓度为0.2 mg/mL时包封率和载药量均相对较高，粒径小于250 nm，故确定TPGS质量浓度为0.2 mg/mL。

表3 泊洛沙姆188质量浓度的考察(, n = 3)

2.5.5 均质压力的考察 岩白菜素投药量为40 mg，单硬脂酸甘油酯用量为500 mg，泊洛沙姆188质量浓度为17.5 mg/mL，TPGS质量浓度为0.20 mg/mL，均质次数为6次，考察均质压力对TPGS- Ber-SLN的影响，结果见表5。结果显示，均质压力在60～80 MPa时对TPGS-Ber-SLN包封率和载药量无显著性影响，但压力达到90 MPa时包封率和载药量出现明显下降情况，可能是均质压力较高时体系温度过高，在表面活性剂作用下使岩白菜素进入水相从而降低了TPGS-Ber-SLN的包封率及载药量。较高的均质压力也使TPGS-Ber-SLN粒径出现增长趋势，为降低过高均质压力带来的影响，故固定均质压力为80 MPa。

表4 TPGS质量浓度的考察(, n = 3)

表5 均质压力的考察(, n = 3)

2.5.6 均质次数的考察 岩白菜素投药量为40 mg，单硬脂酸甘油酯用量为500 mg，泊洛沙姆188质量浓度为17.5 mg/mL，TPGS质量浓度为0.20 mg/mL，均质压力为80 MPa，考察均质次数对TPGS-Ber-SLN的影响，结果见表6。结果显示，随着均质次数的增加TPGS-Ber-SLN包封率和载药量均呈现先增加后下降，而粒径呈下降后增加情况。说明均质次数过少或过多均会对TPGS-Ber-SLN的各项指标产生影响，后续需对均质次数在6～10次进行优化。

表6 均质次数的考察(, n = 3)

2.6 BBD-RSM优化TPGS-Ber-SLN处方工艺

2.6.1 试验方案 结合单因素试验发现单硬脂酸甘油酯用量、泊洛沙姆188质量浓度和均质次数对TPGS-Ber-SLN影响较大，故分别将其作为自变量1、2、3，各水平设置见表7。BBD-RSM仍采用包封率、载药量和粒径作为优化指标，即作为因变量1、2和3。为了得到具有较高包封率及载药量、同时具有较小粒径的TPGS-Ber-SLN处方工艺，将3个指标作归一化处理。

归一值（overall desirability，OD）计算过程为①包封率和载药量计算公式为max＝(M－min)/ (max－min)；②粒径计算公式为min＝(max－M)/(max－min)，其中max和min分别为该试验组中最大及最小值，M为实际值；③OD＝(12…d)1/k。

分别制备TPGS-Ber-SLN，各组均进行3次平行试验，取平均值，结果见表7。

2.6.2 模型拟合、效应面图处方工艺的确定 采用Design Expert V8.0.6软件对试验数据进行拟合，得OD方程：OD＝0.93＋4.03×10−31－9.21×10−32＋0.043＋0.0812＋0.0613－0.2923－0.5112－0.2822－0.2932。

方差分析结果（表8）显示，模型＜0.000 1，2＝0.992 6，adj2＝0.983 1，失拟项＝0.057 7＞0.05，说明所选模型的拟合度较高。OD方程中3、12、13具有显著性差异（＜0.05），23、12、22和3具有极显著性差异（＜0.01），交互作用三维效应面见图2，当固定某一因素时，随着其他2因素（质量浓度、用量或次数）的增加响应值OD均呈现先增大后减小趋势，说明采用BBD-RSM优化TPGS-Ber-SLN处方工艺是非常必要的。

TPGS-Ber-SLN最佳处方工艺为单硬脂酸甘油酯524.71 mg，泊洛沙姆188质量浓度为17.2 mg/mL，均质次数为8.72次。包封率、载药量和粒径的预测值分别为83.87%、5.14%和224.37 nm。

表7 BBD-RSM试验设计与结果(n = 3)

表8 方差分析

图2 不同因素对OD值的效应面

2.7 处方工艺验证

为便于实际操作，将单硬脂酸甘油酯用量调整为525 mg，泊洛沙姆188质量浓度调整为17.5 mg/mL，均质次数调整为9次，按“2.2”项方法平行制备3批TPGS-Ber-SLN，按“2.3”及“2.4”项下方法操作，分别测定TPGS-Ber-SLN包封率、载药量及粒径，并计算各自测定值与预测值的偏差，结果见表9。TPGS-Ber-SLN的包封率、载药量及粒径的偏差均小于±5%。粒径分布见图3，平均PDI为0.099±0.011，平均ζ电位为（−15.67±0.23）mV，ζ电位见图4。

偏差＝(测定值－预测值)/预测值

表9 验证实验结果(, n = 3)

图3 TPGS-Ber-SLN粒径分布

图4 TPGS-Ber-SLN的ζ电位

2.8 TEM观察TPGS-Ber-SLN微观形态

取TPGS-Ber-SLN混悬液0.1 mL，稀释50倍后滴至铜网上，用2%磷钨酸钠染色，置于室温环境晾干，于TEM下放大至12 000倍（高压为5.0 kV），即可观察到TPGS-Ber-SLN的微观形态，结果见图5。结果显示，TPGS-Ber-SLN基本形态为类球形，无粘连。

2.9 冻干粉的制备及稳定性评价

2.9.1 冻干粉种类及处方用量的考察 于TPGS- Ber-SLN混悬液中加入冻干保护剂（乳糖、甘露醇或两者混合物），震荡至澄清，−50 ℃超低温冰箱预冻1 d，取出立即置于−40 ℃冷冻干燥机中，抽真空，冷冻干燥1 d后取出冻干品。按表10进行评价，冻干粉出现塌陷、分层且色差明显、再分散时间大于90 s时表示冻干粉不理想，因而评分较低；反之则表示冻干粉较为理想，评分较高。考察结果见表11，质量浓度为0.05、0.07 g/mL的乳糖和甘露醇（质量比为1∶1）制得的冻干粉得分最高，考虑到辅料用量问题，最终选择5%的乳糖和甘露醇（质量比为1∶1）来制备TPGS-Ber-SLN冻干粉。复溶后测得包封率、粒径和PDI值分别为（81.26±1.01）%、（242.03±15.86）nm和0.116±0.021。TPGS- Ber-SLN冻干前、冻干粉和蒸馏水复溶后样品外观见图6。

图5 TPGS-Ber-SLN的TEM图

2.9.2 TPGS-Ber-SLN冻干粉稳定性考察 TPGS- Ber-SLN冻干粉密封置于恒温恒湿箱中（温度30 ℃，湿度60%），分别于0、5、10、15、30、45、60、75、90 d取样，蒸馏水复溶后测定包封率和粒径，结果见表12。TPGS-Ber-SLN混悬液稳定性较差，但制备成冻干粉后包封率和粒径波动幅度明显变小（PDI值均小于0.2），说明制备成冻干粉后增加了稳定性。

2.10 TPGS-Ber-SLN冻干粉的XRPD研究

采用XRPD对TPGS-Ber-SLN冻干粉进行晶型分析。取岩白菜素原料药、空白辅料、物理混合物（岩白菜素和辅料的比例与TPGS-Ber-SLN冻干粉一致）和TPGS-Ber-SLN冻干粉适量置于样品槽中，玻璃片将样品粉末压制平整后进行扫描。测试条件为Cu-Kα靶，速度为4°/min，扫描角度（2）为3°～45°，结果见图7。岩白菜素原料药在6.97°、8.03°、11.77°、13.45°、14.26°等处的晶型峰相对较强，在物理混合物的XRPD图谱中仍可观察到这些晶型峰，位置未发生变化但强度下降明显。TPGS-Ber- SLN冻干粉XRPD中仅可观察到空白辅料的晶型衍射峰，岩白菜素晶型峰完全消失，说明岩白菜素在TPGS-Ber-SLN冻干粉中晶型发生很大改变，转变为无定型物质。

表10 评分标准

表11 冻干结果(n = 3)

A-TPGS-Ber-SLN混悬液 B-TPGS-Ber-SLN冻干粉 C-蒸馏水复溶后样品

表12 TPGS-Ber-SLN的稳定性考察结果(, n = 3)

取TPGS-Ber-SLN冻干粉密封后置于恒温恒湿箱（温度30 ℃，湿度60%），分别于0、30、60、90 d取样作XRPD分析，结果见图8。TPGS-Ber-SLN冻干粉放置90 d后XRPD图谱中仍未出现岩白菜素原料药特征晶型峰，说明岩白菜素在TPGS-Ber- SLN冻干粉中仍以无定形的形式存在，未出现析晶现象。

2.11 TPGS-Ber-SLN冻干粉的差式扫描量热法（DSC）研究

取岩白菜素原料药、空白辅料、物理混合物（岩白菜素和辅料比例与TPGS-Ber-SLN冻干粉一致）、TPGS-Ber-SLN冻干粉（0、30、60、90 d）适量置于样品槽中测试条件为氧化铝（Al2O3）为参比物，升温速度为10 ℃/min，升温范围为30～300 ℃。结果见图9，岩白菜素原料药在242.2 ℃出现熔点峰，在物理混合物中吸热峰提前至217.8 ℃。TPGS- Ber-SLN冻干粉（0 d）的DSC图谱中未出现岩白菜素原料药吸热峰，说明岩白菜素在TPGS-Ber- SLN冻干粉中以无定型形式存在，与XRPD研究结果一致。在TPGS-Ber-SLN冻干粉的30、60、90 d样品的DSC图谱中仍未出现原料药吸热峰，证明样品稳定性良好。

图7 TPGS-Ber-SLN冻干粉的XRPD结果

图8 TPGS-Ber-SLN冻干粉的晶型稳定性结果(XRPD)

图9 TPGS-Ber-SLN冻干粉的晶型稳定性结果(DSC)

2.12 TPGS-Ber-SLN体外释药行为研究

测得岩白菜素在pH 1.2盐酸水溶液及pH 5.0和pH 6.8磷酸盐缓冲液（PBS）中溶解度分别为（1.58±0.04）、（1.60±0.03）、（0.98±0.02）mg/mL，因此50 mg岩白菜素在体积为500 mL的3种释药介质中可达漏槽条件。按照TPGS-Ber-SLN处方工艺制备Ber-SLN（不加TPGS），并按“2.9.1”项下方法制备成冻干粉末。取岩白菜素原料药、Ber-SLN和TPGS-Ber-SLN冻干粉适量，使岩白菜素含量为50 mg，加入pH 1.2盐酸水溶液5 mL，置于透析袋中（平均截留相对分子质量为12 000），扎紧。释药介质为500 mL的pH 1.2盐酸水溶液，介质温度为37 ℃，转速为75 r/min，分别于0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 h取样3 mL。同法考察在pH 5.0和pH 6.8 PBS中释药情况，取样点调整为0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、4.00、6.00、8.00、12.00、18.00、24.00、48.00 h。样品均过0.45 μm微孔滤膜后进样测定，结果见图10。Ber-SLN和TPGS-Ber- SLN均呈缓释特征，Ber-SLN在不同pH值的释药介质中，释药速率和累积释放度均高于TPGS-Ber- SLN。岩白菜素原料药在pH 1.2盐酸水溶液和pH 5.0 PBS中2 h内累积释放度均达90%以上，但在pH 6.8 PBS中随着时间的延长累积释放度呈现下降趋势，可能是由于岩白菜素在碱性环境中发生降解所致[4,6]。

图10 岩白菜素原料药、Ber-SLN和TPGS-Ber-SLN在pH 1.2盐酸水溶液(A) 及pH 5.0 PBS (B) 和pH 6.8 PBS (C) 中的体外释放曲线(, n = 6)

Ber-SLN和TPGS-Ber-SLN在pH 5.0和pH 6.8 PBS中释药过程均符合Weibull模型（表13），说明释药过程是典型的双相动力学特征。

2.13 口服药动学比较

2.13.1 给药及取血方案 取岩白菜素原料药、Ber- SLN和TPGS-Ber-SLN冻干粉末，采用0.5%的CMC-Na溶液配制灌胃液。取18只健康SD大鼠，过夜禁食，随机分成3组，各只大鼠称定质量后按60 mg/kg ig给药（以岩白菜素含量计）。岩白菜素原料药组分别于0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、8.00 h取血约0.3 mL，Ber-SLN和TPGS-Ber-SLN冻干粉末分别增加10 h和12 h取血点，将血样引流至肝素浸润离心管中，震荡，并以3000 r/min离心（离心半径为6.8 cm）2 min，即得血浆样品。

表13 Ber-SLN和TPGS-Ber-SLN在pH5.0、6.8PBS中的释放模型

2.13.2 血浆样品的处理[6]取100 μL血浆样品和50 μL对乙酰氨基酚内标溶液（质量浓度为800 ng/mL）至离心管中，密封涡旋15 s，加入0.5 mL醋酸乙酯后继续密封涡旋30 s，置于4 ℃离心机中5000 r/min离心（离心半径为6.8 cm）3 min，移取上层有机相。同法再次提取1次，合并有机相，于40 ℃温度下用氮气吹干得残渣，采用100 μL甲醇复溶，待测。

2.13.3 血浆对照品溶液的配制 甲醇配制50、100、250、500、1250、2500 ng/mL的岩白菜素对照品溶液，各个质量浓度分别取100 μL，氮气吹除有机溶液后加入100 μL空白血浆，涡旋30 s后超声30 s混合均匀，即得血浆对照品溶液。

2.13.4 线性关系考察 按“2.13.2”项方法配制岩白菜素血浆对照品溶液，并进样测定岩白菜素和乙酰氨基酚的峰面积。以两者峰面积比为纵坐标（），岩白菜素质量浓度为横坐标（），作线性回归得方程：＝2.231 0＋8.042 6，＝0.996 4，结果表明岩白菜素血浆对照品溶液的线性范围为50～2500 ng/mL。

2.13.5 专属性考察 血药浓度测定时色谱条件与“2.1.1”项下色谱条件一致。取空白血浆、岩白菜素血浆对照品溶液和岩白菜素原料药ig给药8 h血浆样品，分别按“2.13.2”项下方法进行处理，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。色谱图见图11，试验结果表明血浆内源性物质未对岩白菜素和内标峰产生干扰，专属性较高。

图11 空白血浆(A)、岩白菜素＋空白血浆(B)和血浆样品(C)的HPLC图

2.13.6 日内精密度考察 分别取50、500、2500 ng/mL血浆对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件同1 d内分别连续测定6次，计算得岩白菜素和内标峰面积比值的RSD分别为9.05%、4.17%、6.02%，试验结果表明日内精密度良好。

2.13.7 日间精密度考察 分别取50、500、2500 ng/mL血浆对照品溶液每天测试1次，按“2.1.1”项色谱条件连续测定6 d，计算得岩白菜素和内标峰面积比值RSD分别为6.79%、9.32%、5.10%，试验结果表明日间精密度良好。

2.13.8 稳定性考察 取岩白菜素原料药ig给药1 h的血浆样品，分别于0、3、6、9、12、24 h进样测定，计算得岩白菜素和内标峰面积比值RSD为6.07%，试验结果表明稳定性良好。

2.13.9 提取回收率考察[20]取岩白菜素质量浓度为50、500、2500 ng/mL对照品溶液各100 μL，氮气吹除有机溶液后加入100 μL空白血浆，涡旋30 s后超声30 s混合均匀后按“2.13.2”项下方法处理，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定岩白菜素和内标峰面积，并计算两者峰面积比值，带入岩白菜素血浆对照品线性方程＝2.231 0＋8.042 6，计算测得质量浓度及提取回收率，结果显示平均提取回收率为94.98%，RSD为7.18%（＝9）。

2.13.10 定量限考察 取质量浓度为50 ng/mL的岩白菜素血浆对照品溶液，加入空白血浆逐步稀释，按“2.13.2”项下方法处理后进样测定，采用信噪比为10作为定量限，试验结果表明岩白菜素在血浆中定量限为15 ng/mL。

2.13.11 药动学结果 岩白菜素原料药、Ber-SLN和TPGS-Ber-SLN药-时曲线见图12，使用DAS2.0计算主要药动学参数，结果见表14。Ber-SLN与TPGS-Ber-SLN组与原料药相比，达峰时间（max）均发生了显著性延后（＜0.05）；半衰期（1/2）也发生了显著性延长（＜0.05），利于维持血药浓度；峰浓度（max）分别提高至2.63倍和3.91倍，差异具有极显著性水平（＜0.01）；药时曲线下面积（AUC0～t和AUC0～∞）均有极显著性改变（＜0.01），说明Ber-SLN与TPGS-Ber-SLN极大影响了岩白菜素体内吸收过程，生物利用度分别提高至3.37倍和5.34倍。TPGS-Ber-SLN与Ber-SLN相比，max和1/2无明显改变，但max、AUC0～t和AUC0～∞发生了显著性提高（＜0.05），证明TPGS-Ber-SLN更能促进岩白菜素体内吸收。

图12 药-时曲线(, n = 6)

表14 主要药动学参数(, n = 6)

与岩白菜素比较：*＜0.05**＜0.01；与Ber-SLN比较：#＜0.01

*< 0.05**< 0.01bergenin drug substance;#< 0.05Ber-SLN

3 讨论

在制备TPGS-Ber-SLN时先将岩白菜素与磷脂在四氢呋喃中磁力搅拌至体系澄清，此时岩白菜素可与磷脂形成磷脂复合物[4]，从而利于增强岩白菜素溶解度及与单硬脂酸甘油酯的亲和性[18,21]，为后续制备TPGS-Ber-SLN奠定了基础。也有学者认为[19]，药物-磷脂复合物本身可作为固体脂质纳米粒的脂质载体，采用2种以上的脂质载体可防止药物被排出晶格，增加纳米粒的包封率，本研究结果可为脂溶性差的药物制备SLN提供参考。TPGS是一种同时带有亲水和亲脂基团的高分子材料，具有一定的乳化能力，在水中临界胶束质量浓度为249 mg/L[22]，为了防止TPGS从SLN表面逃逸出去自发形成胶束，故确定其在水相中质量浓度为0.20 mg/mL，该用量也与相关研究者采用的用量基本一致[15,17]。

测得TPGS-Ber-SLN平均ζ电位绝对值不足30 mV，稳定性不佳。可能是由于位于TPGS-Ber-SLN表面的TPGS接枝较长，起到了屏蔽作用[23-24]，故将TPGS-Ber-SLN制备成冻干粉来加以改善。糖类保护剂（乳糖）在冻干失去水分时，体系可形成高黏度的玻璃态来防止纳米微观结构发生变化[25]，但糖类保护剂容易出现塌陷现象。甘露醇具有优良的支撑作用，可解决糖类保护剂的不足，因此选用糖类保护剂（乳糖）和甘露醇联用来制备TPGS- Ber-SLN冻干粉。考察发现，采用质量浓度0.05 g/mL的乳糖和甘露醇（质量比为1∶1）来制备TPGS-Ber-SLN冻干粉时外观饱满、无分层、再分散性良好。

岩白菜素原料药在pH 6.8 PBS中累积释放度逐渐降低，而Ber-SLN和TPGS-Ber-SLN在pH 6.8 PBS中的累积溶出度逐渐增加，可能是由于载体的包裹作用提高了岩白菜素稳定性，为后续顺利进入血液循环奠定了基础。TPGS-Ber-SLN释药速率较慢，可能是由于TPGS-Ber-SLN表面的亲水性高于Ber-SLN，疏水性药物更倾向于分布于TPGS-Ber- SLN内部[26]，因而释药更为缓慢；另外TPGS-Ber- SLN表面经TPGS修饰后对药物释放也起到一定的阻滞作用。

Ber-SLN和TPGS-Ber-SLN的max均发生显著性延后，可能与Ber-SLN和TPGS-Ber-SLN缓释作用有关，而且较小的粒径容易使Ber-SLN和TPGS-Ber-SLN滞留于肠道或绒毛间隙中[27-28]，影响了入血速度，因而使max发生显著性延后。Ber-SLN和TPGS-Ber-SLN的1/2也发生显著性延长，有助于维持血药浓度，增加岩白菜素的生物利用度。Ber-SLN和TPGS-Ber-SLN的max分别极显著性提高至2.63倍和3.91倍，说明2种SLN均有效促进了药物吸收。Ber-SLN和TPGS-Ber-SLN口服吸收生物利用度的提高，可能是由于SLN对药物的包裹作用降低了岩白菜素在肠道降解，提高了岩白菜素的稳定性；纳米药物增加了与胃肠道接触面积；提高了岩白菜素累积溶出度；处方中脂质成分可打开肠壁紧密连接，增强药物渗透[12]；纳米药物可经细胞间、淋巴转运等方式进入血液循环[29-30]，最终显著促进了药物吸收。

另外，TPGS-Ber-SLN的max和生物利用度与Ber-SLN相比具有显著性差异（＜0.05），可能是由于TPGS-Ber-SLN处方中TPGS抑制了P-糖蛋白活性，减少了岩白菜素外排作用[15]，因而生物利用度提高幅度更大。

本研究制备的TPGS-Ber-SLN口服相对生物利用度提高至5.34倍，比已报道的固体分散体（提高至1.48倍）[7]、磷脂复合物（提高至439%）[4]及磷脂复合物固体分散体（202.46%）[31]改善幅度更大。后续将研究进一步对TPGS-Ber-SLN药效学、毒理学等进行评价，为TPGS-Ber-SLN提供更为全面的研究资料。另外，只采用TPGS来制备SLN是否具有更高的包封率或生物利用度有待进一步研究。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Formulation optimization of TPGS surface-modified bergenin solid lipid nanoparticles and oral bioavailability study

YANG Jin-zhi1, CUI Xiao-ge1, HAO Hai-jun2, 3

1. Zhengzhou Shuqing Medical College, Zhengzhou 450064, China 2. Shanghai Institute of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201401, China 3. Shanghai Leiyunshang Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai 201401, China

To prepare-α-vitamin E polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS) surface-modified bergenin (Ber) solid lipid nanoparticles (TPGS-Ber-SLN), and investigate its drug releaseand oral pharmacokinetics behavior.High pressure homogenization method was used to prepare TPGS-Ber-SLN. Encapsulation rate, drug loading and particle size were taken as evaluation indexes, single factor investigation method combined with Box-Behnken design-response surface method was employed to optimize the prescription process of TPGS-Ber-SLN. Lyophilized powder of TPGS-Ber-SLN was also prepared. X-ray powder diffraction (XRPD) and differential scanning calorimetry (DSC) were employed to analyze the state of Ber in lyophilized powder of TPGS-Ber-SLN.drug release behavior of TPGS-Ber-SLN in different pH media were investigated by dialysis bag method. Using Ber suspension as control, pharmacokinetics behaviorof TPGS-Ber-SLNand oral bioavailability was compared.Optimal prescription process of TPGS-Ber-SLN was as follow: Ber dosage was 40 mg, glycerol monostearate dosage was 525 mg, poloxamer 188 mass concentrations was 17.5 mg/mL, TPGS mass concentrations was 0.2 mg/mL and homogenization times were nine times. Average envelopment efficiency, drug loading, particle size and ζ potential of TPGS-Ber-SLN were (83.16 ± 1.09)%, (4.97 ± 0.13)%, and (229.46 ± 19.07) nm and (−15.67 ± 0.23) mV, respectively. The drug release process of TPGS-Ber-SLNaccorded with Weibull model. Results of oral pharmacokinetics showed thatmaxof TPGS-Ber-SLN was delayed to (2.07 ± 0.43) h,1/2was extended to (4.21 ± 0.78) h,maxand oral bioavailability were increased to 3.91 fold and 5.34 fold, respectively.TPGS-Ber-SLN significantly altered the pharmacokinetic behavior of Berand increased its oral bioavailability effectively.

bergenin; solid lipid nanoparticles;-α-vitamin E polyethylene glycol 1000 succinate; pharmacokinetics; oral bioavailability

R283.6

A

0253 - 2670(2023)13 - 4144 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.008

2022-11-30

上海市科委项目（21S21903400）

杨金枝（1980—），女，硕士，副教授，从事中药学研究。Tel: (0371)67673621 E-mail: yangjz2007@126.com

通信作者：郝海军（1981—），男，博士，高级工程师，从事中药新型给药系统及质量标准研究。Tel: (021)67103277 E-mail: haohj@shlys.com

[责任编辑 郑礼胜]