高效液相色谱法测定氯嘧磺隆类似物的水解半衰期

梁黄冰，权维燕，王明良

（1.中国热带农业科学院 农产品加工研究所，广东 湛江 524001；2.广东医科大学 海洋医药研究院，广东 湛江 524023；3.深圳大学 化学与环境工程学院，广东 深圳 518060）

磺酰脲类除草剂是一类作用独特的除草剂［1］，具有用量少、高效、杀草谱广、对人畜低毒性等优点，被广泛应用于水稻、小麦、大豆等田间杂草的防控［2］，在全球使用量很大［3］。一些磺酰脲类除草剂虽具有高效的除草活性，但在土壤中的残留持续时间较长，会对后茬农作物造成严重的药害［4-5］。因此，对于新型磺酰脲类除草剂的研发，除了考虑高活性，还需关注其是否具有适宜的降解速率，以免对后茬作物产生残毒。

氯嘧磺隆是商品化使用较多的超高效磺酰脲类除草剂，但在环境中降解较慢。本文以氯嘧磺隆为基础，制备了氯嘧磺隆类似物A：3-（4-氯-6-甲氧基嘧啶-2-基）-1-（2-甲氧羰基苯基）磺酰脲，B：3-（4，6-二甲氧基嘧啶-2-基）-1-（2-甲氧羰基-4-氨基苯基）磺酰脲，采用高效液相色谱法测定氯嘧磺隆类似物的水解特性，为开发药残留少、对环境更加友好的新型除草剂提供指导。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

仪器：LC2000高效液相色谱仪，四元梯度泵，可变波长紫外-可见光检测器（上海天美有限公司）；色谱柱，C18（250mm×Ø4.6 mm，5μm），美国安捷伦公司；BSA224S-CW 电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；UV-2501PC紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；pH 计 （FE20-FiveEasy Plus，METTLER TOLEDO）。

试剂：氯嘧磺隆类似物A和B样品（本实验室自制，w＞95%），甲醇、冰乙酸、无水硫酸钠、磷酸（色谱纯，中国上海阿拉丁试剂公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 高效液相色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×Ø4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇-水 （体积比60∶40，水用磷酸调至pH＝3）；柱温：30℃；流速：1.0mL／min；检测波长：230 nm；进样量：20μL。

1.2.2 标准工作曲线的制备

分别各准确称取25 mg氯嘧磺隆类似物A和B样品于烧杯中，加入适量甲醇超声溶解，转移到250 mL容量瓶中定容即得标样母液。依次取3、6、12、24、48 mL母液至100 mL容量瓶中，稀释定容得质量浓度分别为3、6、12、24、48 mg／L的标准溶液。将上述配制好的标准溶液在给定的色谱条件下进样，以峰面积对质量浓度进行回归得标准工作曲线［6］。

1.2.3 缓冲溶液的配制

①称取16.4 g（0.20mol）乙酸钠，加水超声溶解后，定容至1000 mL，配制成0.2 mol／L的乙酸钠水溶液。

②称取6 g（0.10mol）乙酸，加水用超声波溶解后，定容至500 mL，配制成0.2 mol／L的乙酸水溶液。

③将乙酸钠溶液和乙酸溶液以7∶3（体积比）的比例混合，再用精密pH计检测调成pH＝5的缓冲溶液，密封保存，待用。

1.2.4 样品的水解动力学测定

分别准确称取7.5 mg氯嘧磺隆类似物A和B样品于烧杯中，加少量甲醇，超声溶解，转移至250 mL的棕色容量瓶中。用pH＝5的缓冲溶液定容，并继续超声溶解，得到样品溶液。用4.5μm微孔滤膜过滤后，立即测定其起始质量浓度，然后将剩余样品溶液于恒温箱中25℃避光保存（排除光降解影响），每间隔一定的时间取样，测定其残留量，每次测定都重复3次取平均值，以残留量对取样时间做图，计算化合物在pH＝5缓冲液中的水解半衰期［7］。

1.2.5 定量方法

按氯嘧磺隆类似物的HPLC保留时间及外标峰面积法进行定量［8］。计算公式为：

式中，R为样品中农药残留量（mg／kg）；S样注入样品溶液的峰面积；ρ标标准溶液质量浓度（mg／L）；V终样品溶液最终定容体积（mL）；S标注入标准溶液的峰面积；m样品质量（g）。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

将氯嘧磺隆类似物A和B的甲醇溶液在200～400 nm的波长范围内进行扫描，其吸收光谱如图1所示。

图1 氯嘧磺隆类似物A和B的甲醇溶液紫外吸收光谱图

由图1看出，两个化合物的最大吸收峰在220～250 nm范围内。吸收面积随检测波长的增加而减少，当检测波长较小时，杂质和溶剂也有很多的吸收，样品、溶剂和杂质等分离不完全；而检测波长较大时，杂质的干扰少，但是同样浓度下响应值过小而达不到分析要求［9］。本实验研究选择230 nm作为检测波长，在该波长处样品响应值高，杂质干扰较小，符合农药残留分析的基本要求。

2.2 流动相的选择

对于流动相的选择，有机相主要考虑甲醇或者乙腈，对甲醇和水以及乙腈和水作为流动相进行分离度考察。结果显示，它们的分离度都可达农药残留分析基本要求。但后者毒性较大，且成本较高，故使用毒性较小，成本较低的甲醇。另外，由于磺酰脲类除草剂大部分呈弱酸性，在酸性的条件下是以分子形态存在，而在中性或者碱性以阴离子和两性离子的形态存在［10-11］，实验表明，流动相中的水用磷酸调成酸性水（pH＝3.0），色谱峰型得到改善，目标峰也与杂质峰很好地分离。但酸性过强时，会导致基线不稳定和缩短色谱柱的寿命［12］。

本实验以甲醇和酸性水（pH＝3.0）为流动相，在一定色谱条件下流动相中甲醇体积分数在60% ～70%范围内，考察了其对保留时间和分离的影响，结果见表1。试验表明，在一定范围内，样品的保留时间随着甲醇比例的减小而增大：比例过大时，保留时间过短；比例过小时，保留时间过长。氯嘧磺隆类似物A在甲醇-酸性水体积比为65∶35时的保留时间为8.6min，B在甲醇-酸性水体积比为60∶40时的保留时间为7.3min。两者的保留时间都在7 min以上，能有效地与保留时间较小的杂质峰分离开，故氯嘧磺隆类似物A和B的流动相体积比分别确定为65∶35，60∶40。

表1 氯嘧磺隆类似物在不同流动相下的保留时间min

2.3 流动相流速的选择

分别考察了流动相流速为0.5、1.0和1.5mL／min下色谱的出峰情况：流速较大时，出峰较早，但杂质峰对主峰干扰严重，分离度降低；流速较小时，分离度升高，但保留时间延长，影响实验进度。综合考虑后，选择1.0mL／min作为流动相流速。

2.4 标准工作曲线

图2和图3是氯嘧磺隆类似物A和B的标准工作曲线。从图2、图3看出，在3～48 mg／L范围内，氯嘧磺隆类似物的色谱峰面积与质量浓度具有良好的线性关系，相关系数都大于0.999，符合定量分析的要求。回归方程分别为A：y＝32.82x+7.491，R2＝0.9995，B：y＝41.42x+11.679，R2＝0.9999。

图2 氯嘧磺隆类似物A的标准工作曲线

图3 氯嘧磺隆类似物B的标准工作曲线

2.5 水解动力学

氯嘧磺隆类似物A和B在25℃、pH＝5时的水解动力学曲线如图4和图5所示。相应的水解动力学方程、水解速率常数和水解半衰期见表2。在pH＝5的缓冲溶液体系中，氯嘧磺隆类似物的水解符合一级反应动力学方程，可以用公式ρt＝ρ0e-kt描述。其中，k为水解速率常数，t为反应时间，ρ0为初始质量浓度，ρt为时间的质量浓度。此公式变形为一级反应速率常数，即k＝ln 2／T1／2，T1／2为水解半衰期。因此，依据公式可计算出水解半衰期和水解速率常数［13］。

表2 氯嘧磺隆类似物的水解动力学参数

图4 氯嘧磺隆类似物A的水解曲线

图5 氯嘧磺隆类似物B的水解曲线

由图4和图5的水解曲线和表2的水解动力学参数看出，无光照条件下，在pH＝5的缓冲溶液中，氯嘧磺隆类似物A和B样品溶液的质量浓度ρt均随着时间的增加而不断下降，且水解的相关系数R2分别为0.972和0.901，拟合度较好，故质量浓度与时间之间的关系遵循一级动力学规律。

据文献报道，氯嘧磺隆在pH＝5的环境下水解的半衰期为22.21 d［14-15］。本实验所得的氯嘧磺隆类似物A的水解半衰期为15.57 d，与氯嘧磺隆的相近。氯嘧磺隆类似物B的水解半衰期为8.45 d，表明该氯嘧磺隆类似物有较好的水解特性，对环境更友好，具有较好的应用潜力。

2.6 水解过程的色谱图

氯嘧磺隆类似物A的水解过程液相色谱图见图6。主体化合物的峰在8.4min出现，2～5min是杂质或水解产物峰。氯嘧磺隆类似物B的水解过程液相色谱图见图7。主体化合物的峰在6.8min出现，2～4min是杂质或水解产物峰。从两者的色谱图看出，实验所用的色谱条件能有效地将主体化合物与杂质分开，且主体化合物色谱的峰型对称性较好。

图6 氯嘧磺隆类似物A的水解色谱图

图7 新型除草剂B水解的色谱图

比较两种氯嘧磺隆类似物水解前、水解中期的色谱曲线可以发现，氯嘧磺隆类似物A的主体化合物峰（8.4min）的高度从45降为25，杂质或水解产物峰（5min）的高度从8增加到13。氯嘧磺隆类似物B的主体化合物峰（6.8min）的高度从29降为17，杂质或水解产物峰（3.6min）的高度从4增加到17。即随着水解时间的延长，主体化合物减少，杂质或水解产物增加。

3 结论

确定了检测波长、流动相成分、流动相流速等高效液相色谱法的基本条件。水解动力学研究表明，氯嘧磺隆类似物A的水解半衰期为15.57 d，与氯嘧磺隆的相近。而氯嘧磺隆类似物B的水解半衰期为8.45 d，降解性能优良，具有较好的应用潜力。