金乌骨通胶囊中土牛膝的鉴别研究*

卢娅玲，史 娟，陈 贵

（贵州省黔南州检验检测院，贵州 都匀 558000）

金乌骨通胶囊由金毛狗脊、淫羊藿、威灵仙、乌梢蛇、土牛膝等10味药组成，具有滋补肝肾、祛风除湿、活血通络的功效，用于肝肾不足、风寒湿痹、骨质增生、骨质疏松引起的腰腿酸痛、肢体麻木等症状［1］。目前，金乌骨通胶囊现行标准中缺少对土牛膝的质量控制。处方中土牛膝，在民间特别是少数民族中的应用非常广泛，但各省级地方标准收载的土牛膝植物基原有所不同。在贵州、湖南的中药材标准中，基原与中国药典四部通则所载土牛膝基原是一致的［2］。《中华人民共和国药典》2020版四部通则规定，土牛膝的植物来源为苋科植物粗毛牛膝（Achyranthesaspera L.）的干燥根及根茎［3］，具有活血散瘀、清热解毒、祛湿利尿等功效［4］。土牛膝主要含β-蜕皮甾酮、齐墩果酸等成分。因金乌骨通胶囊中木瓜也含有齐墩果酸，阴性会对检测有干扰，故而不选择齐墩果酸作为鉴别指标。实验拟采用β-蜕皮甾酮对照品和土牛膝对照药材对金乌骨通胶囊中土牛膝进行定性鉴别，结果表明，建立的以土牛膝对照药材为对照的TLC方法可应用于金乌骨通胶囊及土牛膝原药材的质量控制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

AG135型电子天平、AL204型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；SK250LHC型超声仪（上海科导公司）。

1.2 材料

β-蜕皮甾酮对照品（批号111638-201907）、土牛膝对照药材（批号121610-201302），均购于中国食品药品检定研究院；狗脊、乌梢蛇、葛根、淫羊藿、木瓜、姜黄、威灵仙等阴性对照用饮片，均购于都匀市湘君大药房，土牛膝、土党参、补骨脂药材由贵州盛世龙方制药有限公司提供，经鉴定为正品；试剂均为分析纯。15批次金乌骨通胶囊和5批次土牛膝原药材样品信息见表1。

表1 金乌骨通胶囊及土牛膝原药材样品信息

2 方法与结果

2.1 样品提取方法的考察

实验考察了下列几种样品提取方法：①取本品20粒内容物，加65%乙醇50mL，超声处理30min，过滤；滤液蒸干，残渣加水30mL使溶解，用三氯甲烷振摇提取2次，每次30mL，弃去三氯甲烷液，水溶液用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30mL；合并正丁醇液，加氨试液洗涤2次，每次30mL，弃去氨试液，继续用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次30mL；弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇10mL使溶解，作为供试品。②取本品40粒内容物，加水50mL，回流30min，过滤；滤液用乙醚振摇提取2次，每次5mL；弃去乙醚液，水溶液用正丁醇10mL振摇提取，分取正丁醇液，浓缩至约2mL，作为供试品溶液。③取本品10粒内容物，加乙醚40mL，加热回流20min，过滤；取药渣，挥尽乙醚，加70%乙醇60mL，加热回流1 h，放冷，过滤；滤液中加入盐酸2mL，加热回流1 h，浓缩至约5mL，加水10mL，用石油醚（60～90℃）振摇提取2次，每次20mL；合并石油醚液，回收溶剂至干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液。

实验结果：方法②③主斑点未能清晰显现。方法①主斑点清晰，薄层色谱图谱展距适中，故选择方法①为供试品的提取方法。

2.2 各溶液的制备

2.2.1 金乌骨通胶囊供试溶液的制备

取本品20粒内容物，加65%乙醇50mL，超声处理30min，过滤；滤液蒸干，残渣加水30mL使溶解，用三氯甲烷振摇提取2次，每次30mL；弃去三氯甲烷液，水溶液用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30mL；合并正丁醇液，加氨试液洗涤2次，每次30mL；弃去氨试液，继用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次30mL；弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇10mL使溶解，即得。

2.2.2 土牛膝原药材供试溶液制备

取土牛膝原药材2.4 g，同“2.2.1”项下方法制备原药材供试溶液。

2.2.3 土牛膝对照药材溶液的制备

同“2.2.2”项下方法。

2.2.4 缺土牛膝阴性对照溶液的制备

按金乌骨通胶囊质量标准中的处方和制法制备缺土牛膝的阴性对照样品，并取适量，照“2.2.1”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 不同展开系统的考察

供试品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液各取6μL，分别点于同一高效硅胶H薄层板上。分别在①三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（体积比10∶45∶22∶10）；②三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨水试液（体积比50∶20∶10∶2.5）；③乙酸乙酯-乙醇（体积比4∶1）；④环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（体积比20∶5∶8）中展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。

结果：系统①主斑点清晰，分离度良好。系统②③④样品主斑点不清晰，分离度差，故选择系统①为展开系统。

2.4 方法耐用性考察

2.4.1 样品点样量的考察

按提取方法①制成供试品溶液，分别取供试品2、4、5、6、8、10μL，点于同一高效硅胶H板上。以三氯甲烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 （体积比10∶45∶22∶10）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。结果供试品溶液点样量以6μL效果最佳。故点样体积选择为6μL。

2.4.2 温湿度的考察

进 行 了 低 温 （4℃）、室 温 （25℃）、高 温（40℃），低湿度（30%）、中等湿度（50%）、高湿度（80%）的考察。在不同温度和不同相对湿度条件下，样品和土牛膝对照药材均主斑点清晰，分离度良好。

2.4.3 薄层板的考察

考察了不同类型薄层板：高效硅胶H、高效硅胶G、硅胶H、硅胶G，结果表明，高效硅胶H板分离效果最好，故选择高效硅胶H板。

2.4.4 显色剂的考察

考察了5%香草醛硫酸溶液和10%的硫酸乙醇溶液两种显色剂，结果以10%的硫酸乙醇为显色剂斑点不清晰，显色不明显。以5%硫酸乙醇为显色剂斑点显色清晰。故选择5%香草醛硫酸溶液为显色剂。

2.5 鉴别方法

照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各6μL，分别点于同一高效硅胶H薄层板上。以三氯甲烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 （体积比10∶45∶22∶10）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。

2.6 专属性试验

取“2.2”项下各溶液，照“2.5”项下方法试验，结果TLC图谱中主斑点清晰，阴性无干扰。TLC图见图1。

图1 金乌骨通胶囊中土牛膝鉴别专属性试验TLC图

2.7 样品检测结果

15批次金乌骨通胶囊和5批次土牛膝原药材色谱中，在与土牛膝对照药材相应的位置上，均显示相同颜色的主斑点。TLC鉴别图见图2和图3。

图2 金乌骨通胶囊中土牛膝TLC鉴别图

图3土牛膝原药材TLC鉴别图

3 讨论

土牛膝主含β-蜕皮甾酮、齐墩果酸等成分，因金乌骨通胶囊中木瓜也含有齐墩果酸，阴性会对检测有干扰，故而不选择齐墩果酸作为鉴别指标。在以β-蜕皮甾酮作为TLC鉴别指标的研究过程中，采用几种提取和显色方法，金乌骨通胶囊样品均未检出β-蜕皮甾酮。按照标准规定的处方和制法制备含土牛膝的样品，对土牛膝原药材和制备样品进行TLC鉴别，结果原药材检出，而制备样品未检出，说明β-蜕皮甾酮可能在生产过程中发生反应而损失，不能作为金乌骨通胶囊中土牛膝的鉴别指标。本文所建立的薄层色谱方法在与土牛膝对照药材相同的位置显相同颜色的主斑点，展距适中，分离度良好，温湿度对结果影响较小结果稳定、重复性较好。

本文建立的TLC鉴别方法专属性强，可应用于土牛膝原药材及金乌骨通胶囊的质量控制。