中性粒细胞胞外陷阱在风湿免疫性疾病中的作用研究进展

王一茜，张少康，赵德安

(1.新乡医学院第一附属医院儿科,河南 卫辉 453100;2.郑州市第一人民医院神经内科,河南 郑州 450004)

中性粒细胞起源于CD34+造血干细胞,是由骨髓发育而来的终末分化细胞,是人类血液循环中最丰富的白细胞,为先天免疫系统中的短命效应细胞。在血液循环中,中性粒细胞半衰期为 6～8 h,是机体抵御外来微生物的第一道防线。在感染早期,由感染部位释放趋化因子产生趋化作用,吸引中性粒细胞从血流中快速迁移到感染组织,从而有效识别、结合和杀死微生物。吞噬、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、细胞脱颗粒和中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)在免疫调节过程中发挥重要作用[1]。2004年BRINKMANN等[2]用佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)和白细胞介素(interleukin,IL)-8对中性粒细胞进行刺激,发现中性粒细胞内染色质所形成的网状结构可以捕获细菌或病原体,并将这种含有DNA-蛋白质的网状结构命名为NETs。NETs释放细胞内容物并靶向捕获病原体的过程是一种独特的新的细胞程序性死亡方式,即网捕死亡(NETosis)[3-4]。系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、类风湿性关节炎(reumatoid arthritis,RA)、抗中性粒细胞胞质抗体(antineutrophil cytoplasmic antibody,ANCA)相关性血管炎(ANCA-associated vasculitis,AAV) 及川崎病(kawasaki disease,KD)等常见的自身免疫性疾病发病机制仍不十分明确,临床治疗效果欠佳,严重影响患者的生活质量。研究发现,NETs可能在各种风湿免疫性疾病的免疫产生和发病过程中发挥关键作用[5-6]。本文就NETs的形态学特点、作用机制及其在SLE、RA、AAV和KD等免疫性疾病发病过程中的作用研究进展进行综述,以期为风湿免疫性相关疾病的诊治和研究提供新方法及思路。

1 NETs形态学特点和作用机制

1.1 NETs的触发要素及形态学特征

各种兴奋剂在体内外均触发生成NETs,其中以包括PMA、IL-8在内的细胞因子、脂多糖、活化血小板、真核生物、原核生物、补体、自身抗体、尿酸盐晶体、过氧化氢等最为常见[7-9]。由中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)、组织蛋白酶G、蛋白酶3(proteinase 3,PR3)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、乳铁蛋白、明胶酶、溶菌酶C、钙卫蛋白等共同组成的组蛋白、颗粒酶和肽是NETs的主要成分[10]。当机体中NETs生成过多或无法及时清除时,其通过释放多种活性分子来加速炎症过程,从而导致免疫反应的发生。因此,在许多疾病的炎症反应、自身免疫和其他病理过程中,NETs的生成是把双刃剑,起着关键作用[11]。目前,NETs主要分为3种方式:中性粒细胞裂解后所形成的NETs(自杀式NETs)、活细胞通过囊泡释放NETs(存活式NETs)及中性粒细胞在存活状态下释放由线粒体DNA组成的NETs(线粒体式NETs)。

NETs由低级、次级和高级中性粒细胞颗粒组成,也包括高度去浓缩染色质纤维及瓜氨酸化组蛋白等。通过电子显微镜可观察到,在NETs的DNA骨架上存在由组蛋白、颗粒和细胞质蛋白共同组成的直径约为25 nm的球形复合物结构域,其嵌入以脱氧核糖核酸为主要组成部分的直径为15～17 nm的光滑纤维中,并储存于特定中性粒细胞颗粒中,从而提供抗菌性能[12]。THIAMA等[13]研究发现,中性粒细胞受到刺激后,其肌动蛋白细胞骨架会快速分解,使质膜微泡脱落,波形蛋白及微管细胞骨架重塑,内质网囊泡形成,染色质解凝和核分叶性消失,细胞核膜、细胞质膜通透性发生变化,最终导致细胞质膜破裂,细胞游离DNA(cell free DNA,cfDNA)被排出细胞外。

1.2 NETs形成的经典途径

NETs形成的经典途径由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶产生ROS过程介导。PMA可诱导钙二酰基甘油类似物从内质网进入细胞质中,使蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性增强,gp91phox/Nox2通路磷酸化,从而使钙离子释放,激活Raf-丝裂原活化蛋白激酶激酶-胞外调节蛋白激酶途径,促进还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶组装,而吞噬体膜组装由NADPH氧化酶组成的多聚体复合物,进一步诱导ROS分泌,从而激活下游信号通路[14]。NADPH氧化酶及ROS的产生与NETs的形成密不可分。在这个过程中,NADPH氧化酶促使ROS产生是最为关键的步骤,因此也被称为依赖 NADPH的NETosis。

1.3 NETs形成的非经典途径

NETs的非经典途径,即非依赖性NETs形成,是通过线粒体活性氧产生和Ca2+内流介导[15]。线粒体作为提供糖酵解支持的细胞器,在中性粒细胞中含量相对较低;最初认为线粒体不参与NETs发生,随着进一步研究发现,线粒体在病原体反应信号传递过程中起关键作用[16]。有研究发现,在内质网中,被动员的Ca2+浓度在细胞质中明显增加,在线粒体基质中迅速积累并达到膜电位,从而激活非特异性线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP),增加线粒体ROS的产生。同时上述这种氧化应激作用又促进mPTP的开放,使Ca2+内流增加,肽酰基精氨酸脱亚胺酶4被活化,进而使中性粒细胞染色质伸展、解凝聚到细胞外而发挥免疫功能[17-19]。

2 NETs在风湿免疫性疾病中的作用

风湿免疫性疾病最为突出的特征就是炎症反应影响到关节、组织和内脏器官。当自身免疫力下降时,机体产生各种抗体并作用于自身细胞分子,使免疫功能紊乱,引发一系列炎症反应,从而导致组织和器官被破坏。这类疾病的病因及发病机制大多不明,中性粒细胞及NETs在该类疾病发病中可能起一定作用。

2.1 NETs与SLE

SLE为适应性免疫介导的自身免疫性疾病,多发于青年女性。SLE通常累及皮肤和关节,也可影响机体多个系统,甚至危及生命。SLE主要特征是生成抗双链DNA、抗核抗体等多种自身抗体及消耗自身补体。SLE是一种多基因疾病,其发病机制较为复杂,与遗传和环境因素有关,可导致严重适应性免疫功能异常。SLE患者机体内中性粒细胞凋亡增强可导致NETs的释放负荷增强,由此推测NETs可能参与SLE疾病的发展过程。有研究发现,脱氧核糖核酸酶-1降解酶的活性降低导致降解NETs能力下降,这使患者更容易患狼疮性肾炎,由此推断出NETs在SLE发病机制中起着不可或缺的作用[20]。有研究证实,SLE的发生与细胞死亡方式及过多NETs的有效清除有着密切联系[21-22]。过多的NETs可导致SLE患者中cfDNA增多,从而激活自身免疫系统,释放过量的抗核抗原(如DNA和组蛋白等自身抗体)[23],在炎症反应环境中,当机体中凋亡细胞未被及时清除而失去细胞膜完整性时,会出现自身抗原分子,诱发自身免疫反应,导致全身各个系统受累,这是狼疮性肾炎导致SLE患者死亡的最主要原因。蒋秋梅等[24]和张克恭等[25]研究发现,狼疮性肾炎患者不仅NETs水平明显升高,MPO、NE水平也明显升高;同时也证实,SLE的活动程度与NETs的形成增多相关,即NETs水平越高,SLE活动性越强,狼疮性肾炎越易发生,预后越差。

低密度粒细胞(low-density granulocytes,LDGs)最初是在SLE患者外周血单个核细胞中分离的促炎中性粒细胞亚群。SLE患者的LDGs水平明显增加,而LDGs不仅促使炎症细胞分泌IL-6、IL-8能力增强,使细胞吞噬能力受损,还可以刺激T淋巴细胞产生肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ等因子调控基因及蛋白合成,从而诱导产生更多的NETs,导致内皮细胞受损,引发一系列自身免疫反应[24-26]。有学者在转录分析及蛋白质调控2个方面均证实,LDGs作为中性粒细胞亚群促进了NETs生成,并导致小血管损伤,从而导致狼疮性肺炎及狼疮性肾炎的发生[27]。综上可知,NETs既参与了SLE的发病过程,又在狼疮性肾炎发病中起了关键作用。NETs在心肌梗死、中风、心肌病、间歇性跛行及肾炎等发病过程中,除了通过导致内皮损伤途径外,是否存在其他损害途径需进一步研究。此外,弄清楚NETs的哪些组分具有关键核心作用,需要进一步进行分层研究,以便为临床治疗提供精确的干预靶点。

2.2 NETs与RA

RA是滑膜关节的慢性自身炎症性疾病,最主要的临床表现包括关节肿胀和疼痛,其最终可导致关节畸形和功能丧失。在RA滑膜中,淋巴组织B细胞产生单克隆抗体,其中一部分抗体对瓜氨酸化组蛋白H2A/H2B表现出强烈反应,经抗瓜氨酸化-H2A/H2B活性抗体选择性识别的中性粒细胞将会产生大量NETs。RA患者的中性粒细胞更易被刺激而产生NETosis,且表达一些与类风湿性关节炎相关的自身抗体,比如类风湿因子和瓜氨酸化蛋白等[28];此外,NETs作为瓜氨酸化自身抗原的来源,同时能激活损伤关节的关键细胞RA滑膜成纤维细胞,并参与RA关节损伤的发生[29]。cfDNA作为NETs的主要成分,可与体内特定的蛋白结合,形成免疫复合物并激活下游通路,产生大量细胞因子,现已作为检测某些免疫性疾病治疗效果及预测预后的指标。SPENGLER 等[29]通过检测关节腔积液中的cfDNA发现,具有活性的PAD同工酶被死亡的中性粒细胞释放到关节腔中,使精氨酸残基脱亚氨基形成瓜氨酸化蛋白,这将导致释放更多的NETs,进而增加自身抗原产生,使机体免疫功能受损。也有学者提出了相反的结论,认为cfDNA虽然可以作为RA生物学标志物,但RA患者血清中cfDNA水平显著低于健康人群。有研究发现,RA患者cfDNA较健康人群高30多倍,这提示cfDNA对RA有重要作用[30]。综上所述, RA的发生与NETs有着密切联系。

RA患者血液中活化的中性粒细胞异常表达增加,并导致细胞因子被活化、产生ROS,从而延迟细胞凋亡。BACH等[31]采用横断面研究的方法发现,RA患者滑膜液中存在大量中性粒细胞,其被驱动因子激活后,使大量NETs被组蛋白瓜氨酸化后得到释放,从而黏附病原体,破坏关节滑膜,这证明活化的中性粒细胞通过产生大量的NETs来破坏关节滑膜,参与RA的发病。目前,RA的实验室诊断主要依赖类风湿因子(rheumatoid factor,RF)和抗环瓜氨酸肽抗体(anti-cyclic citrullinated peptide antibody,ACPA)检测,已证实APCA滴度与RA的严重程度有关。NETs的形成水平影响着RA的发病与进展,因此,其形成水平或者其中某些成分是否可以作为新型标志物用于RA的诊断或者预测疾病严重程度,仍需要更多的证据。RA主要治疗措施是利用抗风湿性药物缓解病情,但是,尽管有些患者可能在发病初期就接受了规范的治疗,疾病仍有可能会进一步进展,导致患者相关部位功能障碍。有学者发现,雷公藤可显著抑制NETs的形成、嗜中性粒细胞的氧爆发及NETs形成[32]。因此,研发能够抑制NETs形成或者加速NETs清除从而达到缓解和治疗RA的药物,也是今后的研究方向和重点之一。

2.3 NETs与AAV

AAV是一种以小血管炎为特征的自身免疫性疾病,肺出血及肾小球肾炎是其主要的临床表现;包括显微镜下多血管炎、肉芽肿性血管炎及嗜酸性肉芽肿性血管炎[33]。AAV患者血清中MPO/ PR3-ANCA呈阳性表达,其中MPO-ANCA致病性很强,与疾病的活动程度有关。DAVIES等[34]在1982年首次发现ANCA,并认为AAV是一种ANCA 相关的血管炎。KRAAIJ等[9]将99例AAV患者NETs的形成水平与健康个体进行比较发现,ANCA患者NETs的形成明显增多,增多的NETs同时又导致ANCA自身抗原的产生,从而导致恶性循环;以上这种情况在疾病活动期表现更为显著,由此证明,NETs可能是AAV的独立危险因素之一。

研究认为,NETs自身抗原的来源是MPO和PR3[35];也有研究认为,NETs产生的起始信号是ANCA,即中性粒细胞被ANCA过度激活并释放出ROS、NETs等,同时随着细胞因子释放的增加,导致免疫损伤进一步加重[36]。KESSENBROCK等[36]和SU等[37]研究发现,MPO-ANCA与MPO在中性粒细胞上相结合,使位于Fc区与Fcγ的受体发生相互作用,诱导产生ROS和激活肽酰基精氨酸脱亚胺酶4,促使NETs形成。这更加说明,被过度激活的中性粒细胞可导致细胞因子异常产生,使ROS释放增多,促进NETs释放,同时过多的NETs又作为自身抗原再次加剧自身免疫反应,对全身小血管造成损害,使病情进一步恶化[38]。组蛋白H3被认为是 NETs特异性标志物,可使带正电荷的精氨酸残基瓜氨酸化,使离子之间作用消失,染色质解离,这是形成NETosis的第一步[39]。研究发现,在AAV中,组蛋白H3是识别活化中性粒细胞的重要工具之一,其不仅是疾病的特异性标志,同样也是疾病活动的潜在标志[6,40]。DNA酶Ⅰ具有核酸内切酶活性,除了可以降解外源 DNA外,还在降解凋亡细胞和坏死细胞的染色质等方面起到较大作用,且对NETs形成具有负向调节作用。已证实,ANCA-IgG可诱导NETs生成,且血清中 DNA酶Ⅰ活性降低以及抗NETs抗体均可导致NETs形成[41]。综上所述,NETs过度增多或NETs降解能力下降可使NETs增加,进而导致AAV的发生发展。

2.4 NETs与KD

KD是儿童时期继发冠状动脉疾病的重要原因之一。免疫激活是KD急性期的显著特征[42]。KD的具体病因可能与先天免疫失调密切相关,但其确切机制仍未明确。NETs对血管内皮细胞有直接细胞毒作用,可能参与KD的发病过程。研究发现,急性期KD患者的NETs、cfDNA及NE水平均高于恢复期KD患者及健康对照组,提示NETs可能参与了KD的发生发展[43]。在此基础上,有学者通过外源性NETs刺激中性粒细胞证实,KD患者中性粒细胞更易被激发。在NETs刺激下,血管内皮生长因子A和缺氧诱导因子-1α的表达增加,激活磷酸肌醇激酶3主导的磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B /哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路,从而导致血管损伤,引起全身中小血管病变,甚至累及冠状动脉,这可能是KD血管炎发生的病理机制之一[44]。综上所述,NETs与KD发病密切相关。

3 结论

参与机体免疫应答的中性粒细胞受到感染或损伤时,可发挥宿主早期的防御作用。活化的中性粒细胞胞膜脱出核和颗粒成分形成NETs,这种杀菌网络在细胞外捕获和杀死细菌的同时,也会导致易感个体自我耐受和产生自身免疫反应。但NETs在风湿免疫性疾病中精确的信号通路仍需要进一步明确;同样,NETs在IgA血管炎等免疫系统疾病中的相关研究甚少,因此,需要更多的研究探索NETs在免疫系统疾病中的作用。