龙牙楤木组培快繁技术研究进展

2023-07-04武佳欣刘冰雁

安徽农学通报 2023年9期

关键词：组织培养研究进展

武佳欣刘冰雁

摘要本文基于龙牙楤木组织培养技术方面的文献等资料，总结了龙牙楤木外植体的选择、消毒处理、初代培养基、继代培养基、生根培养基、炼苗移栽以及激素选择情况，为后续龙牙楤木的组织培养快繁技术体系建立等研究提供依据。

关键词龙牙楤木；组织培养；研究进展

中图分类号 Q943.1 文献标识码 A

文章编号 1007-7731（2023）09-0028-05

龙牙楤木［（Aralia elata（Miq.）Seem.）］为五加科（Araliaceae）楤木属（Aralia）的灌木或乔木，又名辽东楤木、刺嫩芽、刺老鸦、虎阳刺等[1-3]。龙牙楤木株高1.5～6 m，树皮灰色，上面布满硬刺，小枝上着稀疏细刺[3-4]，楤木的根、茎、叶、花、果实中含有十分丰富的化学成分，如皂苷、木质素、黄酮、挥发油和生物碱等[5-6]，具有一定的医用价值，尤其龙牙楤木的根皮和茎皮，是优良的中药材，具有安神益气、强健脾胃、祛风除湿、化瘀活血的功效[7-8]。有研究表明，龙牙楤木的功效和人参相似，甚至在某些方面对人体的好处要强于人参[1，7，10]。龙牙楤木的嫩芽是一种野菜，具有零污染、低糖分、低脂肪、高纤维的特点。龙牙楤木是药食兼用，且具有观赏价值的经济作物和珍稀植物。

龙牙楤木在我国东北三省均有分布，此外，河北东部地区等地也有分布。在国外，俄罗斯与日本亦有少量分布[4，7，11-12]。多年来人们对野生龙牙楤木的掠夺式采集以及对其生境的破坏，导致大量龙牙楤木灌木丛消失，因此，龙牙楤木资源的保护及利用问题亟须解决。通过资源调查筛选出优良的龙牙楤木，利用组培快繁技术大量生产苗木，可有效解决龙牙楤木资源匮乏的问题。组培快繁技术在龙牙楤木种质资源的保护与研究中具有重要意义[13]。本文从外植体选择，消毒处理，培养基、炼苗移栽以及激素选择方面总结了龙牙楤木组织培养技术，以期为之后龙牙楤木的开发与利用提供一定参考。

1 外植体

1.1 外植体选择

目前，龙牙楤木的组织培养一般选用叶片、叶柄、叶芽、幼茎等器官作为外植体，培育出完整的植株。陈国双等[14]使用休眠芽刚长出的茎尖作为外植体，操作比较简单。陈爱华等[15]的研究表明，龙牙楤木叶片和叶柄作为外植体都能达到很高的诱导率，但叶片比叶柄诱导率较弱。秦亚平等[16]采用龙牙楤木叶片、叶柄、幼茎进行组织培养，结果表明叶片的效果最佳。李建民等[17]研究表明，龙牙楤木茎的诱导率比叶的诱导率高，愈伤组织在茎上更容易诱导出来。吕世友等[18]使用龙牙楤木嫩芽作为外植体获得成功。谢永刚等[19]研究表明，用胚状体繁殖是最快最有效的繁殖方法，不过很容易发生变异；用芽丛繁殖虽然不如胚状体快，但遗传性状稳定，可以筛选和繁殖出性状优良的品种；用茎段繁殖可以克服前两者的缺点，但性状的优劣需要进一步的研究。此外，叶柄、顶芽、幼叶也是常用的外植体[20-23]。孙桂波等[24]研究表明，未完全木质化的茎段、芽、生长点都可以作为外植体。

1.2 外植体消毒处理

消毒剂选择，要求既要有良好的消毒效果，又要能够自行分解或很容易被清洗掉。酒精、升汞、次氯酸钠、氯化银在龙芽楤木组培的消毒中使用最多，可以进行不同种类、不同浓度、不同时间的多种组合，起到“1+1>2”的效果。在用消毒剂处理之前，需要用流水冲洗龙牙楤木外植体之后再进行其他操作。陈国双等[14]先用70%酒精对外植物消毒30 s，然后用无菌水冲洗，再使用浓度为5%次氯酸钠消毒7～8 min；最后用无菌水冲洗4～5次。陈爱华等[15]首先使用75%的酒精消毒30 s，然后用无菌水冲洗1次，再用浓度为1%的次氯酸钠溶液消毒10 min，最后用无菌水冲洗3次。秦亚平等[16]先将外植体放入75%的酒精中浸泡30 s，然后置于浓度为0.1%的升汞中浸泡5～10 min，最后用无菌水冲洗4～5次，每次持续3～4 min。李建民等[17]先将外植体放入70%的酒精中浸泡30 s，再置于浓度为0.1%的氯化银溶液中浸泡5 min，用无菌水冲洗3～4次。吕世友等[18]先用75%的酒精对外植体消毒30 s，之后用无菌水冲洗3次，然后置于浓度为0.1%的升汞中浸泡处理8 min，最后用无菌水冲洗5次。谢永刚等[19]先将外植体放入70%的酒精中浸泡30 s，然后置于浓度为0.1%的升汞中浸泡消毒7 min，最后用无菌水冲洗4～5次。金今松等[20]先将外植体放入70%酒精溶液中消毒10～15 s，然后用浓度为2%次氯酸钠溶液处理10 min，最后用无菌水冲洗3～4次。董衍奎等[22]先将外植体放入70%的酒精中消毒20～30 s，再将其置于浓度为0.2%的升汞中浸泡处理4～5 min，最后用无菌水冲洗5次。徐娥等[23]先将外植体用浓度为1%的升汞消毒6 min，最后用无菌水冲洗5次。孙桂波等[24]先将外植体放入70%的酒精中消毒30 s，再用无菌水冲洗2～3次，置于浓度为0.1%的升汞中处理3～4 min，最后用无菌水冲洗干净。具体消毒时间、消毒剂种类、浓度要视情况灵活运用。

2 培养条件

2.1 培养基

2.1.1 初代培养。龙牙楤木组织培养所用基本培养基为MS培养基，然后加入激素等物质变成完整的培养基。初代培养是为了建立无菌的繁殖体系，从而获得优良的无菌外植体。陈国双等[14]初代培养基选用MS+BA l.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+GA3 0.2 mg/L，并加入20 mg/L青霉素和10 mg/L维生素C防止污染和褐变。陈爱华等[15]经过试验得出MS+2，4-D 1.0 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂55 g/L最为适宜。秦亚平等[16]经过筛选得到的最佳诱导培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L，加入5 g/L活性炭可以有效防止褐变，加入硫酸链霉素可以有效抑制细菌滋生。李建民等[17]研究发现，培养基为MA+NAA 0.5 mg/L+BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L时茎形成愈伤组织的效果最好，培养基为MA+NAA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+BA 0.5 mg/L时叶形成愈伤组织效果最好。吕世友等[18]试验得出诱导阶段培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L。谢永刚等[19]试验得出初代培养基：胚状体使用MS+2，4-D1 mg/L+琼脂9 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭1.5 g/L；丛芽使用MS+NAA 0.02 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7～8 g/L；茎段使用MS+GA 0.03 mg/L+IBA 0.01 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂7～8 g/L。金今松、朴泰浩等[20，26]使用初代培养基MS+2，4-D 1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂9 g/L，并对培养技术进行了改进，用马铃薯淀粉替代琼脂，用白砂糖替代蔗糖，用罐头瓶替代三角瓶，用玻璃纸替代棉花塞，不仅能节省成本，而且试验效果也很好。董衍奎等[22]初代培养基采用MS+IAA 0.1～0.5 mg/L+6-BA 1～5mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂10 g/L。徐娥等[23]初代培养基采用MS+6-BA 2.0 mg/L。孙桂波等[24]采用的初代培养基配方有3种，分别为MS+NAA 0～1.0 mg/kg+GA3 0.2 mg/kg+BA 0.5～l.5 mg/kg+琼脂8 g/L+蔗糖30 g/L，MS+6-BA 1～5 mg/kg+IAA 0.1～0.5 mg/kg+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L，MS+6-BA 2 mg/kg+IBM 0.5 mg/kg+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L。

2.1.2 继代培养。继代培养的目的是使初代培养获得的无菌外植体在短期内按几何倍数大量增殖。陈国双等[14]继代培养阶段培养基选用MS+NAA 1.0 mg/L+BA l.5 mg/L+GA3 0.2 mg/L。陈爱华等[15，28]使用1/2MS+2，4-D 1.0 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂55 g/L作为增殖培养基。秦亚平等[16]研究得出最佳增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L。李建民等[17]继代培养基选用MA+2，4-D 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+BA0.5 mg/L。吕世友等[18]继代培养基采用MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L。谢永刚等[19]选用的继代培养基：胚状体使用MS+BA 0.1 mg/L+2，4-D 2mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+活性炭1.5 g/L；丛芽使用MS+BA 1 mg/L+GA 0.03 mg/L+IAA 0.02 mg/L+琼脂7～8 g/L+蔗糖30 g/L。金今松等[21]增殖培养基采用MS+6-BA 0.1 mg/L+2，4-D 1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂9 g/L。徐娥等[23]采用的增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L。孙桂波等[24]采用的分化培养基有3种，分别为MS+NAA 0～1.0 mg/kg+GA3 0.2 mg/kg+BA 0.5～l.5 mg/kg+琼脂8 g/L+蔗糖30 g/L，MS+6-BA 1～6 mg/kg+IAA 0.1～0.6 mg/kg+2，4-D 1～6 mg/kg+琼脂8 g/L+蔗糖30 g/L，MS+IBM 0.2 mg/kg+6-BA 1 mg/kg+琼脂8 g/L+蔗糖30 g/L。

2.1.3 生根培养。生根培养的目的是使继代培养中没有根的外植体生根，从而成为完整的植株。陈国双等[14]生根培养基选用1/2MS+BA 0.1 mg/L+IBA 0.5 mg/L。陈爱华等[15，27]生根培养基使用1/2MS+琼脂55 g/L+蔗糖20 g/L。秦亚平等[16]生根培养基采用MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L。李建民等[17]生根培养基选用1/2MA无激素培养基。谢永刚等[19]生根培养基选用1/2MS+ IBA 0.5 mg/L+琼脂7～8 g/L+蔗糖15 g/L。董衍奎等[22]采用的生根培养基为1/2MS+IAA 0.1～0.4 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂10 g/L。徐娥等[23]生根培养基采用MS+6-BA 0.1 mg/L+活性炭1 g/L。孙桂波等[24]采用的生根培养基有3种，分别为1/2MS+BA 0.1 mg/kg+IBA 0.5～1.5 mg/kg+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L，1/2MS+IAA 0.1～0.4 mg/kg+琼脂8 g/L+蔗糖30 g/L，1/2MS+IBM 0.5 mg/kg+NAA 0.02～0.2 mg/kg+琼脂8 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭3 g/L。

2.2 炼苗移栽

当组培苗成长到一定规格就需要转移到温室中进行驯化，让其逐渐适应室外的环境，然后将组培苗栽植至事先准备好的基质中。移栽基质是影响组培苗成活率的诸多因素中重要的一个方面[26]，移栽基质要求疏松、透水、通气，有一定的保水性，易进行消毒处理且不易滋生细菌。陈国双等[14]使用珍珠岩+腐殖土（1∶1）成苗速度最快。陈爱华等[15，27]在自然光下先将培养瓶盖拧松1～2 d，然后部分开盖1～2 d，或闭瓶3 d、半开5 d，最后将瓶盖全部去掉，使用移栽基质为腐殖土+蛭石（3∶2），基質先用MS培养液稀释10倍后浇灌。秦亚平等[16]用400 mg/L GA3溶液浸泡幼苗根部2 h，然后转移到基质为无菌园土和蛭石（1∶2）的营养钵中，基质先用水浸透，塑料膜覆盖7 d，期间每3 d用50倍MS培养液浇1次，揭开塑料膜后，在温室炼苗10～20 d即可移入田间。吕世友等[18]使用装有蛭石的营养钵并在钵上铺塑料膜，组培苗的成活率更高。谢永刚等[19]研究得出胚状体炼苗时，当苗长为5～10 cm时，拿到阳光下炼苗3 d，然后移栽到灭菌的蛭石+珍珠岩（1∶1）的育苗盘中，用塑料膜覆盖7～8 d，逐渐通风4～5 d移到室外栽植；丛芽炼苗是从根长1 cm开始，炼苗方法同胚状体；茎段炼苗方法同胚状体或将完全生长好的苗先拿到温室中放置3～5 d，取出后剪成小段，并在下端切口处剪成光滑的斜茬，蘸取500～1 000 mg/L的IBA溶液，插入灭菌的蛭石+珍珠岩（1∶1）基质中，炼苗30～40 d即可移栽。金今松等[20-21]研究得出当苗长4～5 cm时移植到无菌土壤中，使土壤保持湿润状态，炼苗时间15 d；或在苗长到2～3 cm时移植到基质中喷水保湿，用薄膜覆盖，4～5 d后在9：00将膜从侧面打开通风，16：00喷水盖膜，随着幼苗长大逐渐去除薄膜，移栽基质为油母页岩时，成活率最高，苗长势最好。董衍奎等[22]研究得出组培苗生根2～3条时打开瓶盖，2～3 d后移栽到灭菌的腐殖土中，盖上塑料膜，炼苗15 d即可移栽。徐娥等[23]在苗长出5～6片叶时开瓶盖在实验室内炼苗2～3 d，再移到温室炼苗2～3 d，之后移栽至基质为草炭土∶田园土∶优质猪圈粪（1∶1∶1）中。孙桂波等[24]在组培苗生出3～4条不定根时开始进行移栽炼苗，使用灭菌的蛭石和珍珠岩（1∶1）基质，用塑料膜覆盖，7 d后逐渐通风移入苗床。

2.3 激素选择

激素对外植体的存活和生长影响很大，适宜的激素种类、浓度加上激素间的组合能够让外植体快速分化生长。目前，龙牙楤木组培常用的细胞分裂素有6-BA，生长素有NAA、IBA、2，4-D、GA3，激素的不同浓度和不同组合可以发挥出巨大的优势。陈国双等[14]研究表明，NAA比IAA诱导愈导愈伤的效果好，可能是因为IAA不耐高温，高压蒸汽灭菌易遭破坏。添加BA后愈伤组织发生分化且浓度在1.0～1.5 mg/L时分化指数最高。添加0.2 mg/L GA3可以促使芽的伸长生长。陈爱华等[15]研究发现2，4-D在促进愈伤组织形成上活力最高，添加30 mg/L IBA时效果最好，可以诱导出80%以上不定芽。秦亚平等[16]研究发现，在含有2，4-D的培养基中添加适量浓度6-BA会有更好的诱导效果，当6-BA 2.0 mg/L，2，4-D 1.0 mg/L时效果最佳。李建民等[17]研究表明，龙牙楤木愈伤组织诱导时2，4-D浓度起重要作用，浓度越高诱导效果越不好，越易发生褐化，低浓度最适合诱导愈伤组织。

3 展望

龙牙楤木是一种药食同源植物，且兼具观赏性，具有较高的经济价值，但人为大量砍伐和生境的破坏，造成龙牙楤木资源日渐匮乏。传统的繁殖技术已经无法满足人们的需求，组织培养技术是龙牙楤木良种繁育的重要途径之一。目前，龙牙楤木组培快繁技术在幼茎、叶片、叶柄、芽等方面已取得了成功，但不同学者使用的激素种类、组合和浓度有一定差别，另外，消毒剂种类和消毒时间也不同，尚未建立统一的繁殖体系。今后研究中有望建立一个统一的龙牙楤木繁殖体系，以便进行龙牙楤木的规模化生产和推广应用。

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