迷迭香酸及咖啡酸的ESI 四级杆飞行时间高分辨质谱裂解规律研究

刘静，霍志鹏，田介峰，何毅，于治国

（1.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016；2.天士力医药集团股份有限公司研究院 现代中药开发中心，天津 300410；3.天士力医药集团股份有限公司 创新中药关键技术国家重点实验室，天津 300410）

迷迭香酸（Rosmarinic acid，分子式C18H16O8）是一种含多酚羟基的酸，由咖啡酸（Caffeic acid，分子式C9H8O4）和丹参素（Danshensu，分子式C9H10O5）缩合产生，在自然界中分布广泛，主要存在于唇形科、紫草科、葫芦科、椴树科、伞形科的多种植物中。迷迭香酸、咖啡酸有着多方面的生物活性，如强抗氧化性、脑神经保护活性、抗血栓活性、抑菌抗病毒活性、抗炎和免疫抑制活性等[1-2]。液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用技术（LC-Q-TOF-MS）是液质联用技术中最具代表性的方法之一，具有高分辨率、高选择性等特点；目前最常用的离子源为电喷雾（ESI）源，ESI 源是软电离质谱技术，通常可得到准分子离子峰。Q-TOF-MS 可以提供精确质量数，同时多级质谱能提供较为丰富的碎片离子信息，在化合物的定性检测中起到越发重要的作用[3]。近年来有多篇文献采用LC-Q-TOF-MS 的方法对复杂组分中的咖啡酸、迷迭香酸进行定性鉴别以及含量测定[4-5]，但并未对其质谱行为做全面考察，本实验在UPLCQ-TOF-MS 二级质谱（MS2）模式下，通过设置不同的碰撞能量观察咖啡酸以及迷迭香酸形成的各种碎片离子，总结质谱裂解规律。结构示意图见图1。

图1 咖啡酸（Caffeic acid）、迷迭香酸（Rosmarinic acid）结构示意图Fig.1 Structures of caffeic acid and rosmarinic acid

实验部分

1 仪器与试剂

Acquity UPLC-Synapt G2 Q-TOF 色谱-质谱联用仪（美国 Waters 公司）；MassLynx V4.1 质谱工作站（美国 Waters 公司）。

乙腈（质谱级，德国默克公司）；超纯水（杭州娃哈哈集团有限公司）；甲酸（质谱级，东京化成工业株式会社（TCI））；甲醇（色谱级，德国默克公司）；迷迭香酸（纯度96%，美国 Sigma 公司）；咖啡酸（纯度98.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

2 实验方法

2.1 供试品溶液制备

准确称取迷迭香酸10 mg 置于100 mL 量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，得浓度为100 μg/mL 的迷迭香酸溶液。

准确称取咖啡酸10 mg 置于100 mL 量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，得浓度为100 μg/mL 的咖啡酸溶液。

2.2 质谱分析条件

自动进样器进样，在流动相中通过双通导入离子源。流动相为0.1%甲酸水（A），乙腈（B），等度洗脱0～ 1 min，6%（B），流速0.4 mL/min，进样量2 μL。

电喷雾电离离子源（ESI），扫描范围m/z为 50～ 1 000，负离子模式检测：毛细管电压为2.5 kV（ESI-），锥孔电压40 V，提取锥孔电压 5 V，离子源温度为 110 ℃，脱溶剂温度为 350 ℃，脱溶剂气体（氮气）流速为 800 L·h-1，锥孔气流量 50 L·h-1；氩气为碰撞气，准确质量数用亮氨酸脑啡肽作校正液，质核比为m/z554.261 5（ESI-）。咖啡酸二级质谱实验母离子为179.03 Da，碰撞电压为0～ 40 eV，依次递增5 eV；迷迭香酸二级质谱实验母离子为359.07 Da，碰撞电压为0～ 40 eV，依次递增5 eV。

3 结果与讨论

3.1 咖啡酸二级质谱数据分析及裂解规律

咖啡酸的碎片离子强度曲线见图2。负离子模式下咖啡酸的准分子离子峰为m/z179.03，二级质谱碰撞电压为0～ 10 eV 范围内，咖啡酸主要形成准分子离子以及m/z135.04 碎片离子。随着碰撞电压升高，m/ z135.04 碎片离子相对丰度逐渐增大，在碰撞电压为15～ 30 eV 范围内，m/z135.04 碎片离子相对丰度达到100%，准分子离子m/z179.03 相对丰度逐渐降低至0。该范围内可观察到m/z134.03、m/z133.02、m/z117.03、m/z108.02 碎片离子出现，其相对丰度也随碰撞电压的增大而增大。在碰撞电压为35～ 40 eV时，m/z134.03 碎片离子成为基峰。

图2 碰撞能0～ 40 eV 下咖啡酸的碎片离子强度曲线Fig.2 Breakdown curves of caffeic acid (collision energy 0-40 eV)

根据质谱裂解特征，推测的咖啡酸的质谱裂解规律如图3。在负离子模式下咖啡酸的准分子离子峰为m/z179.03，低碰撞能下主要脱去羧基形成m/z135.04 碎片离子。随着碰撞电压升高，m/z135.04 一方面脱去一分子水形成m/z117.02 碎片离子；另一方面发生O-H 共价键均裂生成m/z134.03 的自由基离子，该自由基离子可在高碰撞能下继续裂解，其裂解途径有三种：（1）失去氢自由基形成m/z133.02 碎片离子；（2）丢失乙烯基侧链形成m/z108.02 碎片离子；（3）丢失CO 碎片形成m/z106.04 碎片离子[6]。结合图1可推断出m/z135.04碎片离子结构较为稳定，在碎裂过程中优先失去氢自由基。m/z134.03 碎片离子裂解途径1、2 所需要的能量相当，几乎同时进行，途径3 需在高碰撞能下才能发生。图4～5 为不同碰撞能下的咖啡酸二级质谱。

图3 咖啡酸可能的裂解途径Fig.3 Proposed fragmentation pathway of caffeic acid

图4 咖啡酸二级质谱（碰撞能20 eV）Fig.4 Secondary mass spectrum of caffeic acid（collision energy 20 eV）

图5 咖啡酸二级质谱（碰撞能40 eV）Fig.5 Secondary mass spectrum of caffeic acid（collision energy 40 eV）

3.2 迷迭香酸二级质谱数据分析及裂解规律

迷迭香酸的碎片离子强度曲线见图6。负离子模式下迷迭香酸的准分子离子峰为m/z359.07，二级质谱碰撞电压为0～ 10 eV 范围内，迷迭香酸主要形成准分子离子、m/z197.04、m/z179.03、m/z161.02碎片离子。随着碰撞电压升高，m/z161.02 碎片离子相对丰度逐渐增大，在碰撞电压为15～ 35 eV 范围内，m/z161.02 碎片离子相对丰度达到100%，准分子离子峰m/z359.07 在25eV 电压下相对丰度降低至0；该范围内可观察到m/z135.04、m/z133.02、m/z123.02 碎片离子出现，其相对丰度也随着碰撞电压的增大而增大。m/z197.04、m/z179.03 碎片离子在20～ 35 eV 时，相对丰度逐渐下降，推测这两种离子碎片在高能条件下裂解形成其他离子碎片。

图6 碰撞能0～ 40 eV 下迷迭香酸的碎片离子强度曲线Fig.6 Breakdown curves of rosmarinic acid (collision energy 0-40 eV)

迷迭香酸的质谱裂解规律为低碰撞能下迷迭香酸即可形成m/z161.02 以及m/z197.02、m/z179.03离子碎片。如图7 所示迷迭香酸可在酯键b 处断裂，脱去分子式为C9H8O4的中性分子，形成m/z179.034 9 的咖啡酸离子碎片；也可在酯键a 处断裂形成m/z197.04 的丹参素离子碎片。关于碎片m/z161.02 的形成，一些文献给出了不同的解释：有文献认为m/z161.02 可由m/z179.03 的咖啡酸离子碎片脱去一分子水形成[7-8]，还有文献认为该碎片为酯键a断裂形成的产物[9]；根据前文咖啡酸的二级质谱中并未发现m/z161.02 的碎片离子，因此该碎片离子更有可能为酯键断裂形成的产物。根据图5，m/z161.02、m/z197.04 相对丰度远大于m/z179.03，说明酯键a处较b 处更容易断裂，原因有两方面：一是羟基的电负性强于羰基，故丹参素羟基夺质子的能力强于咖啡酰基[10]；二是a 处断裂形成的m/z161.02 在15～ 40 eV 下相对丰度最高，可见其结构稳定性好，推测羰基碳进攻苯环形成稳定五元环结构。碎片m/z133.02可通过两个途径形成，一是m/z161.02 脱去CO 形成，二是m/z179.03 即咖啡酸碎片离子脱羧基后又脱去两个氢自由基形成，碰撞能35 eV 时，迷迭香酸二级质谱中m/z133.02 相对丰度（46.98%）要比咖啡酸二级质谱中m/z133.02 相对丰度（9.93%）大得多，可见迷迭香酸中m/z133.02 主要由m/z161.02 产生，除此之外咖啡酸碎片的裂解途径与前文3.1 部分裂解途径相同。丹参素碎片离子也可进一步裂解：通过CH（OH）COOH 部分与母环苄基碳碎裂形成碎片m/z123.04、m/z72.99[11]；或脱去一分子水形成咖啡酸离子碎片（m/ z179.03）；也能通过丢失CH2O2碎片形成m/z151.04 碎片离子，其中m/z72.99 碎片离子结构不稳定，在二级质谱中出现的频率较低。图8～9为不同碰撞能下的迷迭香酸二级质谱。

图7 迷迭香酸可能的裂解途径Fig.7 Proposed fragmentation pathway of rosmarinic acid

图8 迷迭香酸二级质谱（碰撞能20 eV）Fig.8 Secondary mass spectrum of rosmarinic acid（collision energy 20 eV）

图9 迷迭香酸二级质谱（碰撞能40 eV）Fig.9 Secondary mass spectrum of rosmarinic acid（collision energy 40 eV）

4 结论

通过使用高分辨质谱对迷迭香酸和咖啡酸可能的裂解规律进行分析，发现这两种化合物在负离子模式下有较好的响应。咖啡酸含有羧基，在质谱裂解中极易脱去一分子CO2产生m/z135.04 碎片离子，高碰撞能下可继续裂解脱去水分子或氢自由基。迷迭香酸作为丹参素与咖啡酸的聚合物，在质谱裂解中可观察到丹参素和咖啡酸的准分子离子，随着碰撞能的加大，这两种离子碎片还可以继续裂解，通过与咖啡酸裂解碎片比对，丹参素部分裂解产生m/ z123.04、m/ z72.99；酯键两种断裂方式分别产生m/ z161.02、m/z179.03 与m/z197.04 碎片离子，为迷迭香酸的特征碎片离子。本研究使用Q-TOF-MS 法研究迷迭香酸和咖啡酸质谱行为，以二级质谱碰撞能为横坐标，碎片离子相对丰度为纵坐标绘制离子强度曲线图，观察离子碎片在不同碰撞能下的动态变化有助于推测断裂发生的位置，从而更详尽地了解分子结构与裂解途径间的关系。