基于生物信息学分析MTMR2 基因在HCC 中的表达及临床意义

李东旭 柳家翠 段怡平 陈梁玥 马甜甜 朱翠雯 张晓洋 喻明霞 唐艳

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，有报道称2025年全球肝癌发病病例将超过100 万例［1］。绝大多数的原发性肝癌病例为肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）［2］。由于原发性HCC 早期临床表现不明显，导致早期诊断和治疗率偏低［3］。即使是肝切除术后的HCC 患者，其术后5 年复发率仍然超过七成［4］。因此，需要寻找新型的HCC 分子标志物提高HCC 患者的早期诊断率。肌管蛋白相关蛋白2（Myotubularin⁃related protein 2，MTMR2）是肌微管素蛋白家族的成员，能参与信号转导、凋亡、周期调节等多种生命活动［5］。也有报道称MTMR2可能和DNA 损伤修复有关［6］。近年来，有研究证实MTMR2与膀胱癌、胃癌、部分非霍奇金淋巴瘤进展密切相关。然而，MTMR2在HCC 中发挥的作用及分子机理尚未明确。本研究利用从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库获得的HCC 及正常样本数据，探讨MTMR2在HCC 患者中的表达及临床意义，并预测其在HCC 中可能的分子作用机制。

1 资料与方法

1.1 数据下载与预处理

在TCGA 数据库检索并下载HCC 的RNA表达数据（包括407 例肿瘤样本和58 例正常样本）及418 例HCC 患者临床数据。利用软件Strawberry Perl 5.32.1.1 将基因表达数据归一化处理用于后续分析。删除临床特征不清晰的样本数据。

1.2 MTMR2 的表达与患者样本临床病理特征和预后的联系

使用R 4.1.1 软件提取MTMR2在HCC 组织和正常组织中的mRNA 表达量，并使用Wilcoxon 检验分析MTMR2在两组样本中的表达差异。根据TCGA 数据库下载的患者信息，利用χ2检验分析MTMR2表达量与患者年龄、性别以及各种病理分期之间的相关性。利用Kaplan⁃Meier 法分析两组之间总体生存率（overall survival，OS）的差异；利用Cox 回归分析MTMR2在HCC 中的预后价值。利用Kaplan Meier⁃plotter 数据库、GEPIA 数据库和OncoLnc 数据库中的生存分析结果验证MTMR2在HCC 中的预后。

1.3 基因富集分析

以Molecular Signature Database 数据库中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 数据集作为功能基因集，利用GSEA 4.1.0 软件对MTMR2进行基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。使用加权富集法，按参数默认值随机组合1 000 次，进行GO（本体论）富集分析，以P<0.05 和错误发现率（false discovery rate，FDR）小于0.05 的基因集作为显著富集的基因。

1.4 免疫浸润分析

使用R 4.1.1 软件评估MTMR2表达与肿瘤浸润免疫细胞（tumor⁃infiltrating immune cells，TIICs）丰度的相关性及免疫系统微环境的影响。使用反卷积算法CIBERSORT（http：//cibersort.stan⁃ford.edu/）分析TIICs 与HCC 中MTMR2表达的关联，并评估在不同样本中免疫细胞浸润水平与基因表达的相对变化。

2 结果

2.1 MTMR2 的表达差异

TCGA 数据集分析显示，MTMR2在HCC 样本中的表达量高于正常样本，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

图1 MTMR2 在HCC 组织和正常组织中的表达差异Figure 1 Differential expression of MTMR2 in HCC tissues and normal tissues

2.2 MTMR2 表达与临床病理特征相关性分析

共有235 名HCC 患者纳入本次研究。其临床及病理特征分析见表1。根据MTMR2在HCC组织中表达水平的中位值（1.374），将患者分为高表达组（MTMR2exp>1.374）和低表达组（MTMR2exp≤1.374）。χ2检验结果显示，MTMR2的表达水平与患者的年龄、stage 分期、T 分期显著相关（P<0.05）。见表1。男性HCC 患者MTMR2表达水平高于女性。见图2A。组织学分级中未分化、中分化、低分化肿瘤MTMR2表达水平均高于高分化肿瘤。见图2B。原发肿瘤T4、T2 期MTMR2表达水平均高于T1 期。见图2C。临床Ⅳ期患者组MTMR2的表达水平显著高于临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图2D。

图2 HCC 患者临床病理特征与MTMR2 表达量的相关性Figure 2 The correlation between clinicopathological characteristics of HCC patients and the expression of MTMR2

2.3 MTMR2 表达与HCC 患者预后的关系

单因素Cox 回归分析结果显示，在HCC 中，stage 分期、T 分期、M 分期以及MTMR2均可以作为HCC 患者的预后因素（P<0.05）。多因素Cox 分析结果显示MTMR2表达（P<0.05）可以作为HCC的独立预后因子。见表2。

表2 单因素及多因素COX 分析Table 2 Univariate and multivariate cox regression analysis

利用Kaplan⁃Meier 法分析两组OS 的差异，结果显示MTMR2高表达组患者的OS 明显低于低表达组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3A。经Kaplan Meier⁃plotter、GEPIA、OncoLnc 数据库验证，均表明MTMR2高表达组患者的OS 较差（Log rankP<0.05）。见图3B⁃D。

图3 MTMR2 的表达与HCC 患者预后分析Figure 3 Prognostic analysis of MTMR2 expression in HCC

2.4 GSEA 富集分析

利用GSEA 得到了MTMR2高表达相关的KEGG 富集信号通路，选择校正后富集得分最高的10 个通路作图。见图4。富集结果显示MTMR2基因高表达样本主要富集在卵母细胞减数分裂、WNT 信号通路和磷酸肌醇代谢通路等分子信号通路。见表3。

表3 GSEA 富集分析结果Table 3Results of GSEA enrichment analysis

图4 MTMR2 基因高表达样本相关富集基因集Figure 4 High expression of MTMR2 gene in samples correlated with enrichment of gene sets

2.5 免疫细胞浸润

免疫细胞浸润结果分析显示，MTMR2表达与中性粒细胞呈正相关（R>0，P<0.05），与调节性T 细胞、活化CD4+记忆T 细胞、CD8+T 细胞呈负相关（R<0，P<0.05）。见图5A。中性粒细胞是受MTMR2表达影响的主要细胞，在高表达组中含量增加（P<0.05）。见图5B。22 种免疫细胞在各样本中的相关含量柱状图见图5C。

图5 MTMR2 表达与免疫浸润Figure 5 Expression of MTMR2 and immune infiltration

3 讨论

MTMR2基因位于11 号染色体（11q22）上，其编码的酪氨酸磷酸酶可以将位于内体区室的底物PI⁃3⁃P 和PI⁃3，5⁃P2 分别去磷酸化为PI⁃5⁃P 和磷脂酰肌醇。目前对MTMR2基因研究的热点是其缺失突变而引起的Charcot⁃Marie⁃Tooth 病4B1 型（CMT4B1），这是一种常染色体隐性遗传的运动和感觉脱髓鞘性神经病［7］。

近年来，MTMR2在多种肿瘤中的作用正逐渐被发现。MTMR2的过表达能够抑制表皮生长因子受体的降解，促进EGFR/PI3K/AKT 通路的持续激活，该通路又可通过上皮⁃间质细胞转换加速肿瘤的侵袭与转移，导致癌症患者的不良预后［5］。MTMR2在胃癌组织中高表达，可通过灭活IFNγ/JAK/STAT1/IRF1 信号促进上皮间充质转化、侵袭和转移，与患者的不良预后密切相关［8］。MTMR2在膀胱癌组织中有稳定的高表达趋势，与细胞上皮间充质转化指数密切相关，能影响膀胱癌细胞的运动和迁移能力［9］。在Sézary 综合征患者中，MTMR2参与了影响基因表达的重排［10］。MTMR2还可以与Janus 激酶1（JAK1）相互作用，导致MTMR2高表达的NK/T 淋巴瘤患者远处转移发生率升高、总生存率降低［11］。MTMR2还与H2O2诱导的细胞衰老相关［12］。Brenner 等［13］应用了新的变异优先级方法识别肺癌病例和对照中的肺癌变异，发现MTMR2与肺鳞状细胞癌的风险增加有关。MTMR14已被证实和肝癌发生发展有关［14］，而同为肌管蛋白家族的成员MTMR2与之有类似的功能与作用，但MTMR2表达与HCC 进展的关系尚未阐明。

本研究以TCGA 数据库中HCC 患者癌组织中MTMR2的表达量及临床信息为基础，通过应用生物信息学方法，探究了MTMR2在HCC 发生发展中的重要作用。结果显示MTMR2在HCC 组织中的表达强于正常组织，其表达水平与患者多种临床及组织病理学特征显著相关。多个数据库的生存分析均显示，MTMR2的高表达会导致患者的不良生存结局。GSEA 富集的KEGG 通路显示上调的MTMR2主要参与了Wnt 信号通路、磷酸肌醇代谢通路、卵母细胞减数分裂等通路。Wnt 信号通路是肝癌发生发展的重要通路，编码Wnt 信号通路中β⁃连环蛋白的CTNNB1基因常在肝癌中出现突变或缺失［15］。

免疫浸润分析显示MTMR2高表达组的HCC组织中的中性粒细胞浸润数量增多。肝癌组织可以分泌趋化因子受体2，该因子可募集血循环中的中性粒细胞迁移至肿瘤部位。中性粒细胞可以加速肝癌细胞的增殖，促进癌组织内血管生成，抑制癌细胞凋亡。中性粒细胞中的某些内容颗粒可通过破坏基质，促进肿瘤的侵袭和远处转移，进而导致肝癌患者不良预后［16］。因此，MTMR2基因在HCC 组织中的高表达可能导致HCC 组织中某些趋化因子分泌增多，诱导中性粒细胞向肿瘤浸润，进而增强癌细胞的侵袭能力，更易引起肿瘤浸润及转移，导致患者的不良预后。

综上所述，与正常组织相比，MTMR2在HCC 组织中表达显著上调，并且能调节HCC 发生发展过程中的某些分子信号途径及TIICs，与HCC 患者的恶性进展相关。MTMR2可以考虑作为HCC 患者的独立预后因素，有望成为HCC 的新型分子标志物。